HMGB1介导的神经发生在皮质发育不良癫痫发生中的作用及机制研究

Cortical dysplasia(CD)is the most important cause of pediatric intractable epilepsy. Previous reports and our investigations have indicated that the abnormal neurogenesis of subventricular zone-derived neural progenitor cells(SVZ-NPCs) may play a key role in the epileptogenesis of CD, however, the mechanisms underlying which are confused. It has been reported that high mobility group box 1(HMGB1) is involved in the migration, proliferation and differentiation of a series of cell types, included stem cells.Moreover,HMGB1 and its receptors are strongly exprssed in the abnormal cell types within the cortical lesions of CD. Accordingly, we speculate that HMGB1 via its receptors, such as RAGE and TLR2/4, modulate SVZ-NPCs's migration towards the cortical lesions of CD and influence the daughter cells' proliferation, differentiation and synaptic plasticity in CD, that would be the potential mechanisms of CD epileptogenesis. In the present project, by using cell culture of SVZ-NPCs, RNA interference and cell transplantation techniques, we aim to explore the expression of HMGB1 and its receptors in the cortical lesions of CD.In addition, we will investigate the effect of HMGB1/RAGE and HMGB1/TLR2/4 pathway on the migration,proliferation and differentiation of SVZ-NPCs, and to discover the influence of HMGB1 and its receptors to the electroencephalograph and behaviour of seizure.According to the above study,we would discover the mechanisms of SVZ-NPCs neurogenesis mediated by HMGB1 pathways in the epileptogenesis of CD associated epilepsy, which would provide a new theoretical basis for the clinical treatment of intractable epilepsy.

皮质发育不良(CD)是难治性癫痫的重要病因。申请者前期研究表明室管膜下区神经前体细胞(SVZ-NPCs)的异常神经发生是CD癫痫发生的关键环节，但其调控机制尚未阐明。文献显示，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）通过受体(RAGE、TLR2/4)在细胞迁移、增殖分化等过程发挥重要生物学功能,且特异性高表达于CD皮质致痫灶的"异构神经元"上。据此我们推测：HMGB1通过其受体调控SVZ-NPCs向CD致痫灶迁移、增殖分化及突触重塑等过程，是CD癫痫发生的潜在机制。本项目运用SVZ-NPCs培养、细胞移植等技术，探讨HMGB1/RAGE、HMGB1/TLR2/4通路：①在CD皮质损伤灶的时空表达规律；②对SVZ-NPCs迁移增殖分化及突触重塑的影响；③对CD痫样脑电和发作行为的影响。初步阐明HMGB1介导的神经发生在CD相关癫痫的发生发展中的作用机制，为难治性癫痫的临床治疗提供新的理论依据。

局灶性皮质发育不良(FCD)是难治性癫痫的重要病因，我们前期研究证实室管膜下区神经前体细胞(SVZ-NPCs)的异常神经发生是FCD 癫痫发生的关键环节，但其调控机制尚未阐明。文献显示，高迁移率族蛋白 B1（ HMGB1）通过其受体(RAGE、 TLR2/4)在细胞迁移、增殖分化等过程发挥重要生物学功能，且特异性高表达于FCD 皮质致痫灶的“异构神经元”上。鉴于此，本项目提出“HMGB1 通过其受体调控 SVZ-NPCs 向FCD 致痫灶迁移、增殖分化及突触重塑等过程，是 FCD 癫痫发生的潜在机制”科学设想。首先，本项目以FCD癫痫组织样本、皮层冰冻损伤FCD模型（FL-CD）为研究对象，系统研究了HMGB1、HMGB1受体(RAGE、TLR2和TLR4)以及部分离子通道（TRPC1、TRPC6等）蛋白水平在皮层损伤灶中的时间、空间表达规律，发现HMGB1/RAGE、HMGB1/TLR2及部分离子通道在外伤癫痫病灶、FCD癫痫病灶中表达上调，初步阐明了HMGB1及其受体在癫痫病灶中的时空表达规律，为“HMGB1及受体信号通路调控SVZ-NPCs参与FCD癫痫发生”的推测提供形态学证据。其次，建立体外培养的SVZ-NPCs细胞株，并研究HMGB1及受体在不同代数离体培养的SVZ-NPCs中的表达规律，发现HMGB1及其受体在第5代离体培养的SVZ-NPCs中表达达到峰值；利用Transwell等技术，从离体水平证实了外源性HMGB1具有增强离体SVZ-NPCs迁移、分化的生物学功能。另外，利用荧光分子探针在体标记、Nestin-GFP转基因小鼠等分别建立FL-CDDiI、FL-CDNestin-GFP模型，进一步证实SVZ-NPCs来源的细胞参与了FCD皮质致痫灶的形成，初步揭示HMGB1可能参与调控SVZ-NPCs向皮质致痫灶迁移分化的过程，但具体机制的细节还有待进一步的研究。此外，在项目实施中，我们还拓展建立了白质下离断损伤癫痫动物模型；设计发明新型控制性皮质撞击损伤模型装置，建立皮质损伤后癫痫模型，为后续的研究奠定了基础。本项目发表SCI论文7篇；获得国家发明专利1项，实用新型专利1项，计算机软件著作权登记证书1项；参加国内学术交流4次，参加国际学术会议1次；与美国斯坦福大学癫痫中心David Prince教授实验室建立合作关系。