细胞分泌因子VSTM2A在结直肠癌中的功能研究及其作为结直肠癌分子诊断标志物的应用价值

Based on the secretome analysis of the The Cancer Genome Atlas RNA sequencing data, V-set and transmembrane domain containing 2A (VSTM2A) was identified as a top-downregulated secreted protein in colorectal cancer (CRC). VSTM2A protein was silenced in CRC tissues and cell lines, which was mediated by promoter hypermethylation. High VSTM2A promoter methylation was an independent prognostic factor of poor survival in CRC patients. Ectopic expression of VSTM2A inhibited CRC cell lines proliferation, induced G2 cell cycle arrest and apoptosis, and suppressed growth of xenograft tumors in nude mice. Secreted VSTM2A significantly suppressed Wnt signaling pathway in CRC cells. We further revealed that Wnt signaling co-receptor LDL receptor related protein 6 (LRP6) was a cell membrane binding partner of VSTM2A. .In a series of studies using colon organoids and conditional knockout mice models, we aim to identify the biological function of VSTM2A using CRISPR/Cas9 Technology, lentivirus-mediated overexpression and purified proteins. We will also investigate the molecular mechanism of VSTM2A in regulation of Wnt signaling. Finally we will evaluate VSTM2A methylation and protein expression in patients with colorectal lesions and its clinical implication by mean of promoter DNA methylation detection and immunohistochemistry. The expected findings of these studies will shed light on the mechanism of VSTM2A tumor suppressive effect on CRC, which may provide a novel target for therapeutic intervention. Furthermore, our study may clarify the clinical potential of VSTM2A as a diagnostic/prognostic biomarker for CRC.

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，而分泌蛋白密切参与结直肠癌的发生发展、肿瘤微环境调控。我们通过分泌蛋白组学和基因组学研究发现，分泌蛋白VSTM2A在结直肠癌中显著下调。我们的前期数据显示VSTM2A可抑制体内体外结肠癌细胞的恶性生长，其甲基化与结直肠癌患者较差预后显著相关。VSTM2A与Wnt受体LRP6相互作用，是一个至关重要的WNT/β-catenin信号通路拮抗蛋白。.本项目拟在生物学功能、分子机制、以及临床应用方面对分泌蛋白VSTM2A进行深入研究。结合CRISPR/Cas9技术、Organoid模型、肠道特异性基因敲除鼠模型，观察VSTM2A对结直肠细胞的生长调控功能；研究VSTM2A与LRP6的结合方式和结合常数；探讨VSTM2A作为结直肠早诊和预后标志物的可能性。本项目将有助于阐明VSTM2A抑制Wnt信号通路的分子机制、并为利用VSTM2A进行基因治疗提供依据。

研究背景：结直肠癌是人类消化系统最常见的恶性肿瘤之一。Wnt/β-连环蛋白信号通路的过度激活是结直肠肿瘤发生的关键步骤。因此研究结直肠癌的Wnt相关通路的分子发病机制并寻找新的结直肠癌分子标志物极为迫切。本课题组分析筛选了4642个潜在的分泌蛋白在结直肠癌中的表达情况，发现VSTM2A是一种在结直肠癌中显著下调的分泌蛋白，并可负向调节结直肠癌中的Wnt信号通路。因此，本课题组研究了VSTM2A在结直肠癌中的功能机制和临床意义。..实验方法：本课题组采用一系列体外细胞、类器官及和动物体内实验，研究VSTM2A的抑癌功能。本课题组利用质谱、免疫沉淀和蛋白质印迹实验鉴定VSTM2A的结合蛋白并研究其结合方式和结合常数。本课题组利用355名结直肠癌患者和TCGA队列中评估了VSTM2A对结直肠癌预后的影响。..研究结果：VSTM2A由于其启动子高甲基化导致其mRNA和蛋白在结直肠肿瘤组织和细胞系中的表达显着降低。VSTM2ADNA的启动子高甲基化和VSTM2A蛋白下调、结直肠癌患者的不良预后显著相关。过表达VSTM2A可以抑制结肠癌细胞系和类器官生长、诱导结直肠细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭、并抑制裸鼠异种移植肿瘤的生长。VSTM2A通过经典分泌途径从结直肠细胞中释放出来。分泌的游离VSTM2A蛋白显着抑制结肠癌细胞中的Wnt信号通路。Wnt信号转导共受体LRP6是VSTM2A的细胞膜结合受体。使用删除/突变和免疫沉淀，本课题组证明了VSTM2A通过IgV结构域与LRP6的E1-4结构域相互识别结合。VSTM2A可以时间和剂量依赖性方式抑制LRP6磷酸化，并诱导LRP6内吞作用和溶酶体介导的降解，最终导致Wnt信号传导失活。..研究结论：VSTM2A是一种新型的经典Wnt信号通路拮抗剂，可直接结合LRP6并诱导LRP6内吞和降解。VSTM2A是CRC患者预后的潜在预后生物标志物。