补骨脂异戊烯基黄酮延缓内皮祖细胞衰老的表观遗传调控研究

Psoralea corylifolia L. is a normal traditional Chinese herb for warming and invigorating the Kidney-Yang and for anti-aging, and contains several prenylated flavonoids. Endothelial progenitor cells play a very important role in the process of repairing vascular endothelial damage which is a factor of priming atherosclerosis. Senescence is a risk of cardiovascular diseases, and also affects cell number, prolifaretion and migration of endothelial progenitor cells and vasculogenesis. To date, though there are a large number of reports that had proved effects of estrogen, eNOS and Sirt3 on anti-senescence, we do not know whether Psoralea prenylated flavonoids as phytoestrogens activate this mechanism in anti-senescence. In the present study, we should observ what effect of Psoralea prenylated flavonoids on senescence of endothelial progenitor cells and vascular endothelial damage, examine how regulation in expressions of eNOS and Sirt3, reveal their mechanisms of signal transduction and epigenetic regulation in the anti-senescence of endothelial progenitor cells in vivo and in vitro by using various methods and techniques, for example, system separation and preparation of psoralen prenyl flavonoids, isolation and culture of bone marrow cells and identification of endothelial progenitor cells, injury operation of carotid artery endothelium, reporter gene luciferase assay, quantitative real-time PCR, microaassay, chromatin immunoprecipitation, flow cytometry analysis.

补骨脂是常用温补肾阳和延缓衰老的中药，含有众多异戊烯基黄酮。内皮损伤是动脉粥样硬化的始动因素，内皮祖细胞在血管内皮损伤和修复过程中发挥极其重要的作用。衰老是心血管疾病的危险因素之一，影响到内皮祖细胞的数量、增生、迁移和血管再生能力。尽管有报告称雌性激素、内皮型一氧化氮合酶和沉默调节蛋白3具有抗衰老作用，但作为植物性雌性激素的补骨脂异戊烯基黄酮能否激活这种抗衰老机制并不明确。本研究将运用补骨脂异戊烯基黄酮的系统分离制备、骨髓细胞分离培养和内皮祖细胞鉴定、颈动脉内皮损伤术、荧光素酶报告基因、实时定量PCR、芯片、染色质免疫共沉降、流式细胞仪分析等方法和技术，在分子、细胞和模型动物水平上，观察补骨脂异戊烯基黄酮的延缓内皮祖细胞衰老和内皮损伤修复的作用，检验补骨脂异戊烯基黄酮对内皮型一氧化氮合酶和沉默调节蛋白3表达的调节作用，解析它们在抗内皮祖细胞衰老中的信号传导和表观遗传调控的分子机制。

一、项目背景：补骨脂是常用温补肾阳和延缓衰老的中药，含有众多异戊烯基黄酮。内皮祖细胞在血管内皮损伤和修复过程中发挥极其重要的作用。衰老是心血管疾病的危险因素之一，影响到内皮祖细胞的数量、增生、迁移和血管再生能力。补骨脂异戊烯基黄酮延缓衰老的机制不明确，本研究从表观遗传角度解析了其抗衰老机制。.二、主要研究结果：（1）发现补骨脂査尔酮是具有延缓细胞衰老、促进血管内皮祖细胞分化和新血管形成的中药活性单体。我们发现补骨脂查尔酮在体内和体外均能激活AMPK激酶和孤核受体RORα活性，调节MnSOD、红细胞生成素和己糖胺通路的去糖基酶O-GlcNAcase(OGA)/MGEA5的表达，逆转DNA主动去甲基化—DNA羟甲基化的过程。（2）在解析细胞衰老过程中，DNA主动去甲基化—DNA羟甲基化的机制是未知的。在分子生物学、细胞生物学和动物实验水平上，运用药理学工具药、基因沉默、基因过表达、人细胞的Crisper/Cas9基因删除、基因敲出、DNA甲基化和DNA羟甲基化全表观基因组测序、免疫荧光组织染色、定量PCR、免疫印记法、染色质免疫共沉降、增强子特定序列羟甲基化测定等众多方法，在体外和体内都证明了①DNA羟甲基化是细胞衰老的一个特征、②TET3是衰老过程中的DNA羟甲基化的主要扮演者、③P53调控TET3的表达、④TET3删除改变炎症等相关基因的DNA羟甲基化和表达。.三、科学意义：（1）补骨脂査尔酮延缓内皮细胞衰老和促进内皮祖细胞分化的调控“阴阳”双向作用，为诠释补骨脂药理学功能提供了一个物质基础，也为今后的深入研究补骨脂的补肾作用机制提供一个良好的前期研究基础。（2）解析衰老状态下的DNA羟甲基化与DNA主动去甲基化酶TET3作用的相互关系的机制具有相当高的学术意义。TET3调控衰老过程中的DNA羟甲基化和炎症性的衰老相关分泌表型补充了衰老过程中表观遗传调控的一种未曾报道的机制。