根癌农杆菌毒力效应蛋白VirD5在植物遗传转化过程中的作用机理研究

Agrobacterium tumefaciens not only is a plant pathogen, but also mediates plant genetic transformation that is the key method for plant genetic improvement. The infection process of Agrobacterium is very complicated, and its mechanism is largely unclear. We found that Agrobacterium virulence protein VirD5 is a putative transcription factor in Agrobacterium infection process. It recognizes a specific DNA element and can bind to the promotor of the host gene At3g49480 that contains the element. Knocking-out of virD5 causes reduction of Agrobacterium mediated stable transformation and affects the expression of At3g49480 gene. We also found that VirD5 can compete with the MicroRNA biosynthesis-related CBC complex for binding to the host Arabidopsis protein VIP2. In this project, we propose to analyze the function of VirD5 and VirD5-regulated host target gene At3g49480 in the Agrobacterium infection process, and elucidate the biological significance of the interaction between VirD5 and VIP2. The results will be conducive to uncovering the molecular mechanism of Agrobacterium-host interactions, and provide theoretical basis for protecting crops from the crown gall disease, enlarging the application range of Agrobacterium-mediated genetic engineering and improving the efficiency of Agrobacterium-mediated genetic transformation.

根癌农杆菌不仅是一种植物病原菌，由其介导的遗传转化更是植物遗传改良的关键手段。农杆菌介导的遗传转化过程极其复杂，其机理在很大程度上仍不清楚。我们发现农杆菌毒力蛋白VirD5是农杆菌侵染过程中一个潜在的转录因子，能识别一个保守的DNA元件，能与含有该DNA元件的宿主基因At3g49480启动子结合，敲除virD5基因导致农杆菌对宿主的稳定转化效率下降并影响At3g49480的表达。我们还发现VirD5可以与MicroRNA合成相关蛋白CBC复合体竞争性结合拟南芥VIP2。本项目拟对VirD5及其调控的宿主靶基因At3g49480在农杆菌侵染过程中的功能进行分析，对VirD5与VIP2等相关蛋白相互作用的生物学意义进行阐释，其结果将有助于揭示农杆菌和宿主相互作用的分子机制，为有效控制冠瘿病危害，扩大农杆菌介导的遗传工程的应用范围和提高农杆菌介导的遗传转化效率奠定理论基础。

利用农杆菌VirD5突变菌株进行植物转化实验发现，从农杆菌中删除VirD5导致农杆菌的致瘤能力和对植物稳定转化效率降低但对植物的瞬时转化效率没有影响。实验证明农杆菌VirD5蛋白与拟南芥AtVIP2蛋白在体内体外都能直接发生相互作用，VirD5、AtVIP2及CBC复合体蛋白(CBP20 andCBP80)不能形成三聚体，VirD5竞争性地影响AtVIP2与CBC复合体蛋白的结合。拟南芥CBP20参与负调控农杆菌介导的植物遗传转化过程，拟南芥cbp80突变体根的致瘤效率没有显著变化，然而，两个拟南芥cbp20/cbp80双突变体（cbp20cbp80-1；cbp20cbp80-2）根的致瘤效率比拟南芥cbp20单突变体根的致瘤效率更高，说明CBP80有增效作用。. 研究发现At3G49480基因（重新命名为D5RF）产生两个转录本，分别编码F-box蛋白D5RF.1和D5RF.2。D5RF.2在N端比D5RF.1长140个氨基酸，都定位在细胞核中。D5RF.1转录本有自己的启动子，且其启动子中含有两个D5RE。VirD5可以直接结合并激活D5RF.1基因的启动子，用敲除了virD5的农杆菌突变体侵染植物时，D5RF的表达下调。D5RF和VirD5一样，影响农杆菌的稳定转化而不影响农杆菌的瞬时转化。对拟南芥T-DNA插入突变体d5rf和野生型Co1-0进行转录组比较分析发现，共有2967个基因存在表达差异，涉及多种功能。. 除以前找到的OsbZIP84外，我们又搜索到一个新的水稻基因编码序列OsbZIP81（XM_015762292）也与拟南芥VIP1高度相似。我们研究发现，该基因至少编码两个蛋白，被命名为OsbZIP81.1和OsbZIP81.2，均定位于细胞核和细胞质，可分别与自身和OsbZIP84形成同源二聚体和异源二聚体，其表达可以被农杆菌、MeJA和PEG6000等胁迫诱导。OsbZIP81.2可以与不同类型的VirE2相互作用，因此，水稻OsbZIP81是拟南芥VIP1的同源基因。JA合成途径中7个基因的启动子可与OsbZIP81.1直接结合。用OsbZIP81.2筛选酵母双杂交文库，最终鉴定到了两个PR类蛋白PR10a/PBZ1和RSOsPR10。. 以上结果为探索农杆菌介导的植物遗传转化机理打下了基础。