西藏杓兰与胶膜菌科菌根真菌基因多样性形成的进化机制研究

Cypripedium tibeticum belongs to the family Orchidaceae. It is a perennial herb, which is endemic and widespread in China. C. tibeticum forms specific mycorrhizae with Tulasnellaceae. During pre-experiment, we found that C. tibeticum and Tulasnellaceae had genetic diversity at genotype and type level, respectively, and the formation of their genetic diversity was associated with coevolution and geographic isolation. This project will clarify the evolutonary mechanism of genetic diversity formation drived by coevolution and geographic isolation of C. tibeticum and Tulasnellaceae. The process are as follows: Widely collect C. tibeticum plant samples and isolate its mycorrhizal fungi; Amplify DNA fragments with suitable molecular markers to analyse genetic diversity and construct phylogenetic relationship of C. tibeticum and Tulasnellaceae, respectively; Use coevolution analysis to illuminate the coevolution relationship between C. tibeticum and Tulasnellaceae; Use correlation analysis to reveal the effect of geographic isolation on the formation of genetic diversity. As a result, this project will elucidate the evolutionary mechanism of genetic diversity formation of C. tibeticum and Tulasnellaceae. This research will provide theory evidence for resource protection, propogation and sustainable utilization of C. tibeticum, and raise a new approach to study the coevolution between orchids and its mycorrhiza.

西藏杓兰(Cypripedium tibeticum)系兰科(Orchidaceae)杓兰属(Cypripedium)多年生草本植物，是我国特有的广泛分布种类，与胶膜菌科(Tulasnellaceae)真菌共生形成菌根。通过预实验发现西藏杓兰和其共生胶膜菌各自存在基因多样性，其形成与协同进化和地理隔离有关。因此，本项目研究协同进化和地理隔离在两者多样性形成中的作用机制。研究内容包括，广泛采集不同地域西藏杓兰居群，分离共生胶膜菌，通过选择西藏杓兰和胶膜菌分子标记分别进行多基因分析，明确两者基因多样性；通过共进化分析，明确两者协同进化关系；通过基因多样性与地理分布相关性分析，明确地理隔离对两者基因多样性形成的影响。从而阐明西藏杓兰和其共生胶膜菌基因多样性形成的进化机制。研究结果将为西藏杓兰资源保护，繁殖和合理利用提供理论依据，同时为探索兰科植物与菌根真菌协同进化关系提供新的思路。

杓兰属植物以其观赏及药用价值一直倍受关注，但由于生境改变和人类活动造成其数量正在减少，甚至已濒临灭绝。在自然条件下，兰科植物菌根真菌对兰花种子萌发，原球茎发育和植株的生长是必不可少的。本研究在四川黄龙自然保护区在海拔3170-3398米的分布范围内采集三种优势杓兰（西藏杓兰、黄花杓兰、无苞杓兰）居群。开发了8个具有多态性的微卫星分子标记来研究供试杓兰居群的遗传多样性和遗传结构。结果发现这8个SSR位点均适用于西藏杓兰群体的遗传多样性分析。将所采集的杓兰海拔居群划分为4个海拔群组评估其固定系数Fst和平均有效基因流Nm。结果发现随着分布海拔的升高，海拔群组内各居群之间的基因交流程度呈现出下降的趋势。两两居群间的固定系数Fst与海拔分布高度差进行相关性分析发现在小尺度海拔分布范围内，杓兰居群间的海拔分布与遗传分化程度存在一定的相关关系，而在大尺度海拔分布范围内，杓兰居群间的海拔分布与遗传分化程度之间的相关性不显著。同时采集了杓兰植物根，利用培养和非培养的方法从根中获得沿海拔梯度上各个样点的植物菌根真菌的ITS序列，以97%的相似性划分分类操作单元。沿用SSR分析中四个群组的划分，发现不同杓兰属植物菌根真菌的群落组成受植物物种的影响比海拔要显著。通过逻辑回归模型和二次曲线拟合数据发现随着海拔的升高，西藏杓兰和无苞杓兰的某些广布菌根真菌出现的可能性会发生改变。代表性OTU构建胶膜菌科真菌的系统发育树显示，OTU IT3单独成为一支，本研究所有得到的其它OTU聚在三个分支上。本论文阐明了三种杓兰属植物沿海拔梯度的遗传多样性；杓兰属植物与胶膜菌科真菌的共生关系存在专一性，但随着海拔的升高（生境的变化）杓兰属植物对菌根真菌群落组成中的不同OTU表现出偏好性。该工作为制定西藏杓兰种质资源保护和利用策略提供理论依据。