14-3-3tau及其DNA甲基化/羟甲基化调控在子痫前期发病机制中的作用

Our previous studies showed that the expression of 14-3-3tau has reguluating effects on the biological behavior of trophoblast, suggesting its possible role in pathogenesis of preeclampsia. We hypothesize that DNA methylation 14-3-3tau regulated by 5hmC and Tet1 is abnormal under hypoxia in placenta, leading to changes of 14-3-3tau expression and histone modifications, abnormal trophoblast and preeclampsia. This study will include three parts: 1) Analysis of characteristics of 14-3-3tau DNA methylation, hydroxymethylation and histone modifications using case-control stuides; 2) Investigating the effects of hypoxia on 14-3-3tau DNA methylation/hydroxymethylation and biological functions; 3) Exploring the role of 5hmC in 14-3-3tau DNA methylation/hydroxymethylation, and histone modifications by regulating Tet1 using transfection techniques. We will apply BSP and MassARRAY for detection of 5mC, histochemistry, ELISA, hMeDIP-Seq for 5hmC, and ChIP assay, nChIP for histone modifications, respectively. The study will provide more information for the etiology of preeclampsia.

本项目在前期研究和预试验的基础上，提出子痫前期可能的发病机制：在胎盘滋养细胞局部氧应激状态下,羟甲基化转移酶（Tet1）参与动态调控14-3-3tauDNA甲基化(5mC)/羟甲基化(5hmC)，14-3-3tau表达和组蛋白修饰改变，影响滋养细胞生物学行为。研究内容：1）采用病例对照研究，分析正常妊娠和子痫前期胎盘中14-3-3tau甲基化/羟甲基化、组蛋白修饰特点。2）采用体外细胞培育，分析滋养细胞株在低氧状态下对14-3-3tauDNA甲基化/羟甲基化状态和对细胞生物学性状影响。3）通过转染技术和RNAi技术，调控Tet1，探究5hmC对14-3-3tau甲基化/羟甲基化、组蛋白修饰的作用。应用BSP、MassARRAY检测5mC，运用免疫组化、ELISA、hMeDIP-Seq检测5hmC，采用ChIP assay、nChIP分析组蛋白修饰。本项目为子痫前期的病因研究提新的思路。

本项目研究14-3-3tau及其甲基化/羟甲基化异常在子痫前期发病机制中的作用。应用免疫组织化学技术及点杂交技术检测胎盘5mc/5hmc的表达情况，发现子痫前期胎盘中5hmc表达降低，5mc表达增加；MeDIP/hMeDIP-seq全基因检测胎盘的5mC、5hmC表达情况，发现重度子痫前期胎盘和正常胎盘组织中有多个差异表达的甲基化及羟甲基化位点，进一步扩大样本量采用MassARRAY EppiTYPER 方法对[h]MeDIP-seq)差异性结果进行验证，有403个基因的5-mc 及119个基因的5h mc出现差异性修饰，提示胎盘DNA 甲基化及羟甲基化异常可能参与子痫前期的发生发展；其次，应用RT-PCR、western blot技术检测胎盘14-3-3tau表达，BSP 检测14-3-3-tau 启动子甲基化情况，发现子痫前期胎盘滋养细胞14-3-3tau 表达显著降低，其启动子呈高度甲基化状态；采用转染技术调节滋养细胞株中14-3-3tau 表达，发现14-3-3 tau 表达降低显著降低滋养细胞分化能力， 提示滋养细胞14-3-3tau表达及其甲基化异常可能参与子痫前期的发病环节；采用缺氧、缺氧/再灌注、LPS 及H2O2 处理滋养细胞株后，western blot 检测14-3-3tau 表达、BSP 检测其启动子甲基化变化，发现缺氧/再灌注、LPS 处理显著降低14-3-3表达水平，启动子甲基化水平增加，提示缺氧再灌注损伤和炎症反应可能通过改变14-3-3tau 甲基化水平改变其表达水平；采用RNA-SEQ 技术检测14-3-3 tau si-RNA干扰后其下游受影响的主要信号通路，其结果未回。最后，采用免疫组化技术、western blot 技术检测胎盘组蛋白甲修饰差异情况，发现子痫前期高表达H3K4me3、 H3K27me2/3、 H3K9me1/2、H3K36me2， 低表达H3K9me3、 H3K79me2、 H3K36me3；调节滋养细胞株14-3-3tau 表达后，发现抑制14-3-3tau无法改变上述差异修饰组蛋白水平。 本项目在发现子痫前期胎盘基因呈现甲基化/羟甲基化差异性改变及组蛋白甲基化修饰改变，并在组织和细胞水平上阐明14-3-3tau表达及甲基化改变情况、其可能的影响因素及受调节的下游关键信号通路。