多头带绦虫新粘附蛋白TmAdh家族的鉴定和功能研究

Taenia multiceps is a cestode parasite with its larval stage (metacestode), Coenurus cerebralis, mainly encysts in the central nervous system of sheep causing cerebralis coenurosis. This tapeworm disease leads to death of intermediate hosts and huge socioeconomic losses for sheep production, and it also cause zoonotic infections in humans, which is one of the neglected zoonotic parasitic disease. . In our previous studies, three new genes were identified from T. multiceps, we had confirmed the proteins have a capacity of adhesion and referred to as a new protein family members. The phylogenetic analysis that showed the three proteins were slightly distinct from previously reported host-protective proteins/high protective antigen, formed a distinct cluster, but its structure is highly conservative. This study will further analyze the number and structure of the protein family, determine the expression and localization at different developmental stages of the parasite, reveal the immune protection of proteins for the challenge infection. And further study the function of parasite invasion host for TmAdh proteins using CRISPR/Cas9 system. This study not only will provide new drug target molecules, and also provide reference for study of other homologue proteins in cestodes such as Taenia saginata and Taenia asiatica.

脑多头蚴病是由多头带绦虫幼虫寄生于绵羊等中间宿主中枢神经系统引起的一种寄生性绦虫蚴病，该病引起感染宿主的最终死亡，对养羊业造成巨大的经济损失，而且人也能被感染，是一种被忽视的人兽共患寄生虫病。. 在前期研究中我们从多头带绦虫成虫及幼虫转录组中首次鉴定出3个新蛋白，已证实该蛋白具有粘附活性，认为是带属绦虫新的粘附蛋白家族。序列分析初步发现它们与其它带绦虫六钩蚴特异性粘附蛋白/高保护性抗原序列明显不同，但是结构高度保守。本研究拟进一步分析多头带绦虫粘附蛋白TmAdh家族成员的数量、基因结构，确定其在不同发育时期的表达差异以及在虫体组织的定位，明确其重组蛋白的免疫保护性，应用CRISPR/Cas9系统研究其对虫体入侵宿主的功能。本研究不但为新型疫苗和药物研制提供重要的靶分子，而且可以为其它带科绦虫如牛带绦虫和亚洲带绦虫的相关研究提供借鉴。

本研究以多头带绦虫成虫及幼虫转录组中首次发现的3个具有FnIII结构域的新蛋白为背景，研究以多头带绦虫基因组DNA为模板，通过PCR扩增出6个分别含有N端信号肽和1个FnIII结构域的基因序列，命名为TmAdh1~6，六个基因序列一致性在44.9-99.2%；进化分析发现该蛋白家族属于带科绦虫免疫保护性抗 原家族的一个新的亚类。对TmAdh1~4 四个基因分别进行原核表达，并对表达产物进行反应原性、组织定位及细胞黏着活性检测。建立了TmAdh3重组蛋白对绵羊脑多头蚴病间接ELISA检测方法，评价了TmAdh3作为检测抗原的敏感性和特异性。另外，针对TmAdh2 基因设计Guild RNA，并应用CRISPR/Cas9 技术对多头带绦虫虫卵进行TmAdh2基因编辑。结果：在pGEX-4T-1原核表达系统分别表达出大小约为39.0、38.1、38.9和37.8 ku的重组蛋白并进行纯化，免疫印迹检测发现TmAdh3重组蛋白与脑多头蚴自然感染绵羊血清反应明显，应用rTmAdh3 蛋白建立的ELISA方法检测绵羊脑多头蚴病的敏感性为83.3%（15/18），特异性为94.4%（17/18）。免疫组化表明TmAdh1-4重组蛋白主要分布于脑多头蚴原头节的上皮、顶突、小钩。细胞粘附活性试验表明该蛋白都具有细胞黏着活性。动物免疫保护性实验结果显示TmAdh1、TmAdh3和TmAdh4重组蛋白免疫绵羊后抗体水平都显著上升，三免后达到峰值，攻虫后抗体水平开始逐渐下降。动物免疫保护实验表明TmAdh1、TmAdh3、TmAdh4重组蛋白的减虫率分别为61.71%、53.17%、50.76%。明确了Tmadh3重组蛋白可作为羊脑多头蚴病的早期诊断抗原。应用Tmadh2针对多头带绦虫虫卵进行CRISPR/Cas9基因编辑尝试。结论：本研究为脑多头蚴病疫苗的研制奠定基础。