CsHB1与CsTPD1协同调控柑橘体细胞胚发生的分子机理

The regeneration technique of somatic embryogenesis is essential for plant theoretical and applicable research, and to sustain the capacity of somatic embryogenesis of callus is also important for the citrus genetic improvement. Our previous study showed that the overexpression of CsHB1 gene could promote the process of citrus somatic embryogenesis. To further explore the roles of this gene in somatic embryogenesis, we did yeast 2-hybrid and found that Tapetum Determinant 1 (CsTPD1) was a potential interactor of CsHB1. In this study, BiFC and Co-IP technologies will be employed to ascertain their relationship and identify the essential regions for interacting. Genetic analysis will also be performed to investigate how both proteins affect the acquisition of the embryogenic capacity and the transformation of callus to embryos, and RNA-seq experiment will be carried out in transgenic lines to find out those pathways significantly affected. Our study will provide a fundamental basis for uncovering the regulatory mechanism of CsHB1/ CsTPD1 during the somatic embryogenesis process.

体细胞胚发生的离体再生技术已成为包括果树在内的植物基础研究以及应用研究中重要的实验环节，保持并恢复愈伤组织的体细胞胚发生能力已经成为推进柑橘种质改良的重要举措。我们已有研究表明CsHB1基因可促进柑橘体细胞胚发生，进一步通过酵母双杂获得了与其互作的基因CsTPD1。为了进一步证实两个基因的功能，本研究拟采用BiFC、Co-IP来明确CsHB1/CsTPD1的互作关系，寻找互作的核心功能域；进而利用遗传分析检测技术明确CsHB1/CsTPD1二者的相互作用是如何影响柑橘愈伤组织胚性能力的获得及向胚状体的转变，最后拟采用RNA-seq检测转基因株系，详尽分析其中发生显著变化的分子途径和代谢通路，我们的研究将为深入阐明CsHB1/CsTPD1二者在柑橘体细胞胚发生过程中的调控机制提供理论依据。

愈伤组织离体保存是柑橘种质资源保存和进行柑橘生物技术育种非常有效的手段。但是柑橘品种间体细胞胚发生能力差异很大，有些品种目前还未获得胚性愈伤组织。同时，长期保存的胚性愈伤组织其胚性能力也会随着继代时间的延长而逐渐减弱。因此，保持并恢复愈伤组织的体细胞胚发生能力已经成为推进柑橘种质改良的重要举措。项目组围绕前期获得的促进体细胞胚发生的基因CsHB1开展调控机制研究，利用不同胚性能力的柑橘愈伤材料，取得以下的研究结果。①利用CsHB1超量表达愈伤组织，筛选获得转基因愈伤体细胞胚诱导不同时期差异表达基因，功能分析发现这些差异基因显著富集于胁迫反应、叶片发育、韧皮部或木质部发生、体细胞胚和胚后发育等过程；②ChIP-seq挖掘CsHB1下游调控靶基因，鉴定出4616 peaks，3043个基因，明确CsHB1蛋白可结合的基序，通过EMSA 和LUC确认互作位点；③利用酵母双/单杂交筛选获得3个与CsHB1互作的蛋白（CsLOB41、CsKIN1β1和CsAHL15 LIKE），采用BIFC、Co-IP、LUC确认CsHB1蛋白可在植物体内与CsLOB41、CsKIN1β1和CsAHL15 LIKE蛋白直接作用；④利用筛选获得的关键基因，创制超量表达材料研究其功能。研究结果在理论上丰富了柑橘体细胞胚发生作用机制，为未来利用柑橘体细胞胚发生进行柑橘育种提供了基因资源和理论基础。