养心通脉有效部位方对BMSCs作用靶点及信号转导通路的研究

骨髓间充质干细胞（BMSCs）治疗缺血性心脏病，存在诱导分化、存活及归巢心肌组织百分率低，向非目的细胞的转化甚至癌变等问题亟待解决。本项目组前期工作发现养心通脉有效部位方（apr-YTF）对心肌缺血大鼠的BMSCs具有体外诱导向心肌分化、移植归巢于心肌组织、动员外周血CD34-细胞数增多的作用。本项目拟运用免疫蛋白组学方法揭示apr-YTF对BMSCs膜蛋白作用靶点、磷酸化蛋白组学方法发现apr-YTF对BMSCs酪氨酸磷酸化蛋白，然后用生物信息学方法，挖掘出其达差异和关联的细胞膜蛋白和磷酸化酪氨酸蛋，再采用Pathway Studio 5.0软件建立已鉴定蛋白的信号通路网络并进行免疫共沉淀(Co-IP)和Western-blotting验证。本项目从系统生物学水平揭示apr-YTF对BMSCs膜蛋白作用靶点及其信号转导通路，为从系统、整体水平解释中医药"多因、多效、多靶点"机制奠定基础。

为了探讨养心通脉有效部位方（apr-YTF）对体外培养骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜蛋白作用靶点及信号转导通路开展研究。（1）采用核素标记相对和绝对定量（iTRAQ）、TOF/TOF串联质谱分析结合SWISSPROT数据库进行检索鉴定蛋白的方法对apr-YTF对体外培养BMSCs膜蛋白免疫蛋白质组学进行了研究，质谱分析结果显示在apr-YTF组和阴性对照组筛选和鉴定出236个蛋白，满足peptides＞2，Pval＜0.05，115∶113＞1.2和115∶113＜0.8条件的蛋白有62个，其中表达上调的有48个，表达下调的有14个。（2）采用2D-DIGE、TOF/TOF串联质谱分析结合SWISSPROT数据库进行检索鉴定蛋白的方法对apr-YTF对体外培养BMSCs磷酸化蛋白质组学进行了分析，结果发现上调磷酸化蛋白4个。（3）根据apr-YTF对BMSCs作用差异蛋白，通过DAVID数据库搜索软件结合 GO数据库搜索，进行注释和富集度分析，KEGG数据库进行信号转导通路分析，VISANT、String数据库检索蛋白质相互作用，MetPA和HMDB数据库对其代谢产物网络途径进行分析。结果发现差异蛋白主要参与102种生物学过程、35种细胞组分、6种分子途径,差异蛋白主要参与3条信号转导通路，这些蛋白在3条信号转导通路上相互发生作用。处于差异蛋白功能交互网中交叉点位置的Presenilin-1、Presenilin-2通过Notch 信号通路，Syntaxin-4蛋白通过可溶性N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白附着蛋白（SNARE）信号通路，丝裂原活化蛋白激酶12（MAPK 12)通过MAPK信号通路在apr-YTF诱导BMSCs向心肌分化过程中发挥作用。（4）根据生物信息学的预测，对研究中MAPK、Notch通路进行了生物验证，结果JNK信号通路参与apr-YTF导BMSCs心肌定向分化过程。结论认为apr-YTF对BMSCs的作用是在多位点、多环节、多种生物学进程中发挥作用，蛋白质组学生物信息学技术可以站在“整体观”的角度对中医药的作用机制作出预测，结合分子生物学验证是一条很好的中医药现代化途径。.项目按计划完成，已发表相关论文8篇，其中SCI收录2篇，录用未发表6篇。