基于转录组和代谢组学分析研究西红花苷生物合成相关CYP450基因及调控机制

Plant cytochrome P450 play an important role in synthesis of many secondary metabolites including terpenoids. Crocin, belonging to diterpenes glycosides, are primary metabolites in Crocus sativus. There is no systematic research on CYP450 genes related to crocin biosynthesis and regulation mechanism. Based on our previous research, we have obtained the differential expressed genes in crocin stigma for -3da, da and +2da flowering stages according to Illumina/solexa transcriptome sequencing technology and bioinformatics research. In this study, we intend to analyze the CYP450 genes with different expression in crocin stigma for different flowering stages in-depth study: verifying the gene expression, analysing the tissue-specific expression and co-expression pattern with known crocin biosynthesis genes by qRT-PCR; cloning the full-length sequence of the candidate P450 genes by 5’-RACE and 3’-RACE. Then combined diterpenes biosynthesis genes expression with diterpenes peak intensity based on the correlation UPLC/Q-TOF MS to elucidate the molecular mechanisms resulting in differential marks. There is no report on CYP450 genes related to crocin biosynthesis by transcriptome sequencing and metabolism technologies. The study is expected to identify a group of P450 genes related to crocin biosynthesis, and will provide theoretical evidence for research on molecular mechanisms of crocin biosynthesis and future regulation crocin content through the bioengineering, and further supply a new research route for cytochrome P450 and plant metabolism.

植物CYP450基因参与调控植物萜类化合物的生物合成，西红花苷是二萜糖苷类化合物，参与其生物合成的P450基因目前尚无系统研究。本项目在前期西红花不同花期柱头转录组测序及差异表达基因分析的研究基础上，重点对不同花期柱头中的差异表达P450基因进行深入研究：利用qRT-PCR基因表达分析技术对获得的P450基因进行表达验证、组织特异性表达分析和与已知西红花苷生物合成基因的共表达分析，并通过5’-RACE及3’-RACE克隆候选P450基因全长；结合UPLC/Q-TOF MS代谢组学技术分析柱头发育过程中差异表达的P450基因与次生代谢标志物含量的相关性。通过转录组测序与代谢组学技术研究西红花苷生物合成相关CYP450基因在国内外尚无报道。本项目的实施可获得西红花苷生物合成相关的CYP450基因，为进一步阐述西红花苷生物合成分子机理和通过生物工程调控西红花苷含量提供理论依据。

植物CYP450基因是植物体内的一类重要功能基因，参与次生代谢产物的生物合成和植物体的生物解毒。西红花苷是名贵中药西红花的主要药效成分，其含量决定着西红花的品质。西红花苷是萜类物质，其生物合成涉及到三个主要的次生代谢途径包括上游的MVA和MEP途径以及下游的类胡萝卜素代谢途径。目前调控西红花苷生物合成的基因已有报道，但未涉及到植物CYP450基因。本项目在前期研究基础上，以西红花不同花发育阶段的柱头为研究材料，通过高通量转录组测序技术获得西红花柱头的转录组信息，并结合RT-PCR基因表达分析技术对获得的P450基因进行表达验证、特异性表达和基因共表达分析，并通过RACE技术对差异表达基因进行全长克隆；同时利用UPLC/Q-TOF MS代谢组学技术分析西红花不同花发育阶段柱头中差异性代谢物，分析发现不同花发育阶段的代谢物差异，并最终获得西红花苷及生物合成前体物质的含量，最后对差异表达P450基因与西红花柱头差异性代谢物含量的相关性进行分析。研究结果显示西红花不同花发育阶段的柱头中转录因子和代谢产物都有较明显的变化，尤其是I期和III期，表明花发育过程中代谢产物随着基因的调控发生变化。转录组差异表达基因筛选获得12个显著差异性表达的P450基因，并进行表达验证和共表达特性分析。最后通过差异表达基因在不同组织的表达分析，确定了在柱头中特异性高表达的4个基因CYP72A15、CYP97B2、CYP71A1和CYP86A8并获得完整的基因全长序列。代谢组分析筛选到138个显著性差异化合物，结合文献，Rt和MS鉴定到12个涉及西红花苷生物合成通路中的化合物。运用Metabo Analyst4.0分析这些物质的峰面积强度与4个推测CYP450基因表达的相关性发现相关性较好，结合差异性代谢物的KEGG pathway 代谢通路注释结果，推测CYP72A15、CYP97B2、CYP71A1和CYP86A8基因参与zeatin biosynthesis和Carotenoid biosynthesis代谢途径的基因调控，而这两条代谢通路是西红花柱头中萜类物质骨架形成的重要通路。本项目研究结果为进一步阐述西红花苷生物合成的分子调控机制和通过生物工程调控西红花苷含量提供理论依据，同时也可为CYP450基因与植物代谢的研究提供新的研究思路。