SVP及下游信号miR172在柑橘一年多次成花中的作用和机制

成花是果树产量形成的基础，成花时间、数量与质量，直接或间接地影响果实的成熟期、产量与品质。柑橘类植物只有少数种类和品种有一年多次开花现象，如果能将多次开花性状引入大宗柑橘品种，将可在无霜冻地区或保护地实现柑橘成花、果熟的人工调控和错季节生产，增加果农收益，减少贮藏损耗和能源浪费。SVP近年来被认为是植物常温成花调节途径的关键基因，miR172是其发生作用的信号分子。课题组前期发现SVP与早花变异枳一年多次成花有关，本项目以一年多次开花和一年一次开花的不同柑橘类型对比，分析SVP与miR172在柑橘类植物多次成花中的表达模式，采用嫁接方法研究miR172在柑橘维管组织中的传导性和确切作用，通过靶基因扫描及其在嫁接和转基因植株中的芯片表达谱变化研究其作用机制。本研究完成有助于揭示柑橘植物乃至其他木本植物一年多次成花的分子机理，为进一步在果树生产实践中调控花期和错季节生产提供理论依据和技术储备。

前期研究发现早实枳与普通枳不同，在当年萌发形成的春梢上可以开二次花。本研究对一、二次花形成关键时期基因表达检测发现，SVP表达量变化与花形成吻合，原位杂交表明，顶端分生组织在向花分生组织转变时，其内SVP表达下调，转变完成后又恢复上调。进一步分析表明，二次花形成过程中，与SVP下调对应，下游miR172的表达上调。对SVP互作蛋白及其上下游调控基因的酵母单、双杂交研究表明，SVP存在多个互作对象，既可以与FLC的关键转录本FLCv5互作，进一步与下游靶基因AGL24和SOC1启动子结合，也可与SOC1和AP1基因直接互作调控成花。对具二次花形成能力的早实枳和不具二次花形成能力的普通枳在自剪前后小RNA测序分析发现，microRNA组分占有较高的比例。从中检索到141条已知的miRNAs和发现75条可能的新miRNA。种间保守的miRNAs在早实枳或普通枳都可检测到，但新的miRNAs的特异性很强，仅在早实枳或普通枳中发现，并且表达水平较低，推测可能参与特异代谢过程的调控。75条新的miRNAs中有51条预测到了靶基因，总共得到了317个潜在的靶基因。大多数miRNAs都存在着多个靶位点，并且还有多个miRNAs共同靶定同一个靶基因。对这些靶基因分析发现其中转录因子占较大比例，除了发育调控，还参与了防御响应、组蛋白调控及其它代谢过程。对miR156或miR172表达模式鉴定分析表明，虽然它们均参与了早实枳的成花转变，但前者随着年龄时期变化，表达逐渐降低，可能与阶段发育调控有关；而后者随着顶芽自剪，呈现周期性变化，与成花关系更为直接。对柑橘不同种属miR172不同成员的进化分析发现，早实枳miR172-03和miR172-12与一年多次开花的四季橘来源的miR172关系更密切，可能与多次成花调控有关。进一步采取人工控水促进四季橘二次开花，分析发现，中度控水可有效促发二次花，同时控水使SVP表达下调，miR172表达升高，与其成花数量密切相关，表明SVP和miR172确实参与了四季橘的二次成花调控。将miR172用农杆菌介导法转入烟草，获得阳性转化植株，表型分析证明，超表达miR172-12可有效促进转基因植株提早成花，且其雌蕊较雄蕊先熟。miR172超表达枳转化植株由于嵌合现象在后期生长过程中逐渐湮没，未观察到转基因表型，后续转化苗在进一步观察中。