基于二仙汤和逍遥散方证相关的母婴分离模型小鼠证候基础研究

早年不良经历是精神行为疾病的重要危险因素，母婴分离可使海马糖皮质激素受体（GR）的表观遗传学发生改变，影响下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA），增加抑郁症易感性，前期工作基础表明：疏肝解郁加用温阳组成的复方可调节母婴分离小鼠的HPA轴功能。本课题以二仙汤、逍遥散及二者合方作用于母婴分离模型小鼠作为研究对象，观察海马不同分区GR启动子表观遗传学变化，并与反映HPA轴功能状态的相关指标及焦虑、抑郁行为学数据关联，确定母婴分离模型小鼠所属证候及反映其方证相关的生物学基础。借助Roche-NimbleGen CpG启动子甲基化芯片观察海马关键分区全基因组DNA启动子的甲基化状态，推导相关基因甲基化调控网络，探索母婴分离模型小鼠方证相关的表观遗传学特征及科学内涵，为临床防治早年不良经历所致抑郁症等相关病症提供证候学基础。

早年不良经历（母婴分离）可显著影响大脑的发育和行为模式，导致神经内分泌敏感性改变，成为精神疾病的潜在危险因素，表观遗传学改变是早年不良经历后果持续影响到成年的重要原因。本项目通过对焦虑/抑郁行为、社会认知记忆等行为的检测显示，母婴分离可使小鼠对环境压力和刺激的敏感性增高，社会认知功能下降；逍遥散对母婴分离小鼠常态下反应异常及社会认知功能调节较好，温阳解郁方对刺激条件下行为异常调节作用较强。母婴分离还可导致应激后及Dex/CRH试验血浆皮质酮异常，形成HPA轴高反应状态，但温阳、解郁、温阳解郁复方对此均未显示有明显的调节作用。母婴分离小鼠的GR exon 1 甲基化程度及甲基化转移酶1（DNMT1）明显增高，温阳药二仙汤和温阳解郁方降低甲基化程度的作用较为明显，说明海马GR exon1甲基化程度变化可能是母婴分离导致HPA轴异常的重要原因，中药复方可以通过相关表观遗传学变化达到治疗目的。原位杂交、real-time PCR分析发现，温阳药二仙汤及温阳解郁方对HPA轴的相关指标如GR/MR/CRHR1调节作用较大，而逍遥散及温阳解郁方对BDNF（神经可塑性的主要指标）的调节作用较大，提示温阳与HPA轴功能状态有关联，解郁与神经可塑性有关联。通过运用甲基化芯片对全基因组启动子甲基化状态的检测发现，母婴分离小鼠出现1058个基因启动子高甲基化，718个基因高去甲基化，温阳解郁方和氟西汀的调节基因谱与母婴分离的高甲基化基因拟合度较高，两者的促甲基化（副作用）相对较少，三个中药复方促去甲基化相近，氟西汀明显多于其它3组。经pathway和生物网络分析发现，母婴分离小鼠高甲基化基因主要与神经发育、细胞骨架和基因转录调控有关；低甲基化基因主要与离子通道和离子结合有关，经过筛选出与神经功能有关的基因关键节点基因有Actb、Creb1、Sos1、Rhoa、Plcg1、Map3k3、Gsk3b、Casp3、Wnt3a、Grin2c、Grm4、Slc17a8、Ntrk2、Bdnf、Amph、Adcy8、Cdk5。由此得出母婴分离小鼠证候属性与温阳解郁方所属证候拟合度高，且温阳和解郁调节不同的生理功能，本项目研究方式是对方证相关研究模式的一个新尝试，经研究形成的行为评价方法和关键节点基因为类似证候的评价和动物模型的复制奠定基础，同时温阳解郁法为临床治疗早年不良经历相关病症的提供了新思路。