提高产溶剂梭菌双链切口修复效率以实现高效基因组编辑

Solventogenic clostridia are an important class of industrial microbiology, which is lacking of efficient tools for genetic manipulation. The main reason is that the homologous recombination efficiency in solventogenic clostridia is low. Even if double strand gap is introduced, recombination efficiency is not high enough. Also, solventogenic clostridia are lack of NHEJ (non-homologous end joining) repair mechanism. In Escherichia coli and other microorganisms, Red/ET system could be introduced to improve the efficiency of homologous recombination, but no such work is reported in the clostridium..In this project, firstly a testing system will be established for the efficiency of homologous recombination and NHEJ system in type strains of solventogenic clostridia including Clostridium acetobutylicum ATCC824 and Clostridium beijerinckii NCIMB8025; then through the activation of endogenous elements and introducing exogenous components, homologous recombination and / or NHEJ efficiency of Clostridium will be enhance; when necessary, recombination-promoting genes will be screened from Clostridium phages for further enhancing repairing efficiency; finally by combination of cut and repair, efficient genome editing systems for solventogenic clostridia will be established. This project will also provide suggestions for other microorganism with low homologous recombination / NHEJ efficiency.

产溶剂梭菌是一类重要的工业微生物，尚缺精细高效的遗传操作工具。原因在于产溶剂梭菌自身同源重组效率低下，即使引入双链缺口，也难以高效修复，而且产溶剂梭菌没有NHEJ（非同源末端连接）修复机制。大肠杆菌等微生物中，可引入Red/ET系统提高同源重组效率，但梭菌中尚无成功的报道。 本项目拟首先在产溶剂梭菌模式菌株丙酮丁醇梭菌ATCC824和拜氏梭菌NCIMB8025中，建立同源重组和NHEJ效率检测系统；而后通过激活内源元件如RecO、RecG、RecA和导入外源元件如RecU、RecET 以及待挖掘的噬菌体促同源重组基因或Ku、LigD，提升梭菌的同源重组和/或NHEJ效率；最终构建产溶剂梭菌中高效基因组编辑系统，并为其他同源重组/NHEJ效率低下的微生物进行基因组编辑提供借鉴。

项目背景：.产溶剂梭菌可以在发酵过程中可将多种碳源转化为乙醇、丁醇、丙酮等化学品和生物燃料，是一类重要的工业微生物。本项目计划构建溶剂梭菌中高效基因组编辑系统，对于产溶剂梭菌的基础和应用研究有重要意义；也可为其他同源重组效率低下的微生物进行遗传操作提供借鉴。.主要研究内容：.本研究首先在体外建立拜氏梭菌的甲基化修饰系统，让待转化的质粒先经体外甲基化系统修饰后再进行电转，提高外源DNA在拜氏梭菌中的转化效率，以利于后续工作开展。.原计划使用的spCas9介导的切割在两种产溶剂梭菌中效果不佳，在没有引入sgRNA的情况下，也能杀死宿主；本项目中改用Cpf1进行染色体切割。利用Cpf1切割结合梭菌自身的重组修复机制，成功构建出基因编辑系统。.探索CRISPR-Cpf1切割结合NHEJ修复，尝试构建相应的基因编辑系统；但未获成功。选择了三种不同物种来源的NHEJ系统(Ku+ligD)进行测试，目标位点均显示为野生型。很遗憾最终未获成功，推测原因是备选的Ku+ligD在梭菌中活力较低所致。.此外，为了绕开同源重组和NHEJ修复双链切口相对困难的问题，联合使用胞嘧啶脱氨酶Apobec1和CRISPR-Cas9D10A刻痕酶，在拜氏梭菌中成功建立了碱基编辑系统，形成一种新型的基因组编辑工具。.重要结果：.以上述两种成功的思路，构建了两种较为高效的产溶剂梭菌基因编辑工具。尝试用于生产菌株已获得成功。.关键数据：.Cpf1系统和碱基编辑器系统，用于产溶剂梭菌的编辑效率分别可达25%和83%。.科学意义：.基于Cpf1的编辑系统将每轮原需一周以上的基因组编辑操作周期缩短至五天。碱基编辑器质粒则能将构建所需引物从6条缩减至2条。有助于产溶剂梭菌的基础和应用研究。