活性氧在竹黄菌发育分化及竹红菌素合成中的调控作用研究

Hypocrellins, naturally occurring perylene quinones isolated from a parasitic fungus Shiraia bambusicola, are new type of non-porphyrin photodynamic agents. High quantum yield of reactive oxygen species (ROS) released by their photochemical reactions is responsible for their photoxicity and anticancer activity. Although ROS are recognized as a second message in the life activity of plant and mammalian cells, there are less reports on ROS role on microbes themselves. It is of scientific significances to explore the impact of endogenous ROS on fungal differentiation and hypocrellin biosynthesis. Under the dark and light conditions we will observe ROS burst and explore the kinds of free radicals produced by photochemical reaction or catalyzed by endogenous enzymes such as NADPH oxidase (NOX) and glucose oxidase (GOX). With the treatment of ROS donor (H2O2, menadione), antioxidants (Vitamin C or E) and inhibitors of NOX or GOX, the ROS regulation on fungal differentiation from initiation of conidation, mycelium growth to sclerotia phase and stroma formation will be revealed. The MAPK signaling cascade and cell apoptosis induced by ROS will send the regulation messenger on key enzymes in the pathway of hypocrellin biosynthesis. The differential gene expression by cDNA-AFLP analysis and the characterization of some enzymes responding to ROS signal will be obtained. The methods for stroma cultivation and anamorphosis fermentation will be established for higher hypocrellin yields. We believe our ongoing results will be helpful in the application of ROS regulation on agricultural and biotechnological production hypocrellin and more new photosensitivity perylenequinones. Our research will give hints or theoretical basis of ROS modulation on production of fungal-derived drugs for photodynamic therapy.

竹红菌素是从竹黄菌（Shiraia bambusicola）中分离发现的新型光敏药物，竹红菌素光敏化产生的活性氧是导致其生物活性的重要因素。活性氧又被誉为细胞生命活动的第二信使，探讨活性氧对竹黄菌自身发育分化与竹红菌素合成的调节作用，对了解微生物生命活动中活性氧信号作用与光敏性物质合成具有重要的理论意义和应用价值。我们以课题组筛选和选育的竹黄菌为对象，通过光/暗周期诱导考察竹黄菌中活性氧产生来源与种类；外施活性氧供体（H2O2,甲萘醌）、抗氧化剂或NADPH氧化酶及葡萄糖氧化酶抑制剂探讨活性氧对孢子萌发、菌丝生长、微核与子座形成的作用；通过活性氧细胞信号转导以及对竹红菌素合成的影响，利用cDNA-AFLP进行基因差异表达分析，获得竹黄菌中对活性氧有响应的菌丝分化和竹红菌素合成特异酶基因；建立竹黄子座人工培育与竹红菌素发酵生产的诱导调节方法，为竹红菌素等真菌光敏药物的生产提供理论基础和参考。

竹红菌素光敏化产生的活性氧是其抗肿瘤、抗病毒和抗菌活性的重要因素。本项目研究了内源活性氧对竹黄菌（Shiraia bambusicola）生长、发育及竹红菌素生物合成的影响。通过竹红菌素高产的竹黄菌株S9的诱导培养（光暗比、红光诱导、超声刺激），发现竹黄菌中氧自由基（O2-和H2O2）产生不仅来源于竹红菌素的光敏化反应，而且主要源自菌丝内NADPH氧化酶（NOX）催化的生理反应。我们首次克隆到参与竹红菌素生物合成的SbNOXA基因和具有特殊抗氧化意义的竹黄漆酶基因。我们应用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-AC）和外源H2O2处理菌丝体，并通过分析竹黄孢子、菌丝和子实体的基因转录表达，首次发现竹黄菌丝甲基化程度极低，活性氧明显抑制了竹黄菌气生菌丝的发生、促进了分生孢子器的生成和分生孢子的数量。5-AC通过降低活性氧的水平，形成白色绒毛状表型，抑制孢子萌发和竹红菌素的合成。研究发现活性氧通过调控菌丝发育调控因子WetA及三聚体蛋白Velvet复合物（VelB/VeA/LaeA）从而对真菌生长发育及次级代谢实现共调节。活性氧进一步诱导凋亡相关的信号转导基因（诱导死亡蛋白、高敏响应蛋白及多种丝裂原活化蛋白激酶等），导致凋亡发生。我们筛选了活性氧诱导下竹红菌素合成的候选基因（如单氧酶（monooxygenase）和氧甲基转移酶（O-methyltransferase）等），完善了竹红菌素生物合成途径。基于活性氧调节生理机制，我们发展了促进竹红菌素发酵生产的生物技术，如光照（光质、光量）、超声和稀土镧诱导技术，不仅使菌丝内竹红菌素的合成增加，而且促进了竹红菌素的外排。活性氧不仅激活竹红菌素合成通路上相关基因，而且还促进与竹红菌素外排转移相关的腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（SbABC）和主要协助转运蛋白超家族（major facilitator superfamily transporter）的表达，协调菌膜脂成分的合成和调节细胞膜通透性，介导竹红菌素的外排。我们的研究首次开展了内源活性氧信号在光敏药物产生菌上的诱导研究，研究结果为理解活性氧对真菌次生代谢诱导作用机制提供了帮助，同时也为提高竹红菌素产量的生物技术发酵提供了诱导刺激技术。