SARA损伤瘤胃上皮细胞紧密连接的机制与营养干预研究

亚急性瘤胃酸中毒（SARA）是严重危害我国肉牛及高产奶牛健康的一类营养代谢病。我们初步发现，SARA导致瘤胃上皮屏障受损，瘤胃脂多糖发生移位，但其确切机制和干预措施尚不清楚。本课题拟在此基础上，通过活体诱导SARA试验及体外模拟酸中毒致瘤胃上皮细胞受损模型，应用Ussing chamber、实时荧光定量 PCR、Western blot和免疫荧光-激光共聚焦显微镜观察等方法进一步研究：1、SARA对瘤胃上皮屏障通透性和瘤胃上皮细胞紧密连接的影响；2、从紧密连接蛋白的表达和磷酸化修饰以及细胞信号转导途径的角度，探讨SARA损伤瘤胃上皮细胞紧密连接的机制；3、解析谷氨酰胺对SARA下瘤胃上皮细胞紧密连接的屏障功能的防护作用及机制。本课题将深入认识SARA的潜在危害，在组织、细胞和分子水平上阐明SARA损伤瘤胃上皮细胞紧密连接的机制，为瘤胃上皮屏障功能的防护与修复提供思路和理论依据。

前期研究表明，亚急性瘤胃酸中毒（SARA）导致瘤胃屏障功能受损，但SARA损伤瘤胃上皮屏障的分子机制并不清楚。本项目将从组织、细胞及分子层面系统研究SARA对瘤胃上皮屏障功能的影响及谷氨酰胺的防护作用，并探索SARA损伤瘤胃上皮细胞紧密连接的细胞信号传导机制。动物试验一选用10头装有永久性瘤胃瘘管的去势公山羊，随机分为饲喂全粗料的对照组（Hay；0%谷物；n = 5）和饲喂高谷物的处理组（HG；65%谷物；n = 5），连续饲喂7周。结果表明，高谷物饲喂成功诱导本试验中的山羊发生SARA，同时在长期饲喂的过程中，SARA的发病有一个发生、适应、继续发生的过程。长期高谷物饲喂诱发的SARA导致瘤胃内环境紊乱，从而影响瘤胃上皮形态结构的完整性，表现为细胞间连接被破坏，各层细胞损伤和坏死，改变瘤胃上皮紧密连接蛋白的表达和分布，使瘤胃上皮屏障功能破坏，激活瘤胃上皮局部免疫反应，引发瘤胃上皮免疫稳态失衡，使瘤胃内LPS等毒性物质易位成为可能，最终影响动物生产性能。动物实验二选用12头健康奶山羊随机分为高精料组( n = 6 )和高精料添加谷氨酰胺组( n = 6，50g/d 过瘤胃保护谷氨酰胺的添加量 )，连续饲喂4周。结果表明，高精料日粮下添加过瘤胃谷氨酰胺可降低瘤胃上皮的炎症反应，改善上皮紧密连接，从而维护瘤胃上皮屏障的正常功能。瘤胃上皮体外细胞培养实验表明，SARA诱发的瘤胃低pH值和高浓度LPS可导致瘤胃上皮细胞紧密连接蛋白表达变化，并且激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路；而抑制MAPK/ERK1/2信号通路活化，可缓解由SARA诱发的瘤胃上皮紧密连接损伤。