哈茨木霉Th-33产分生孢子相关基因的克隆及功能验证

木霉菌是目前研究和应用最多的植病生防真菌，其产分生孢子特性与木霉制剂生产及生防效果有密切关系。但目前尚无其分生孢子形成相关基因的报道。本课题组采用ATMT方法获得了哈茨木霉Th-33的2株产孢突变株1413和446，本项目拟以这两株突变株为研究菌株，采用Tail-PCR技术克隆产孢突变株中T-DNA标签的侧翼序列，通过步移扩增全长序列，经生物信息学分析获得基因全长，再根据获得的基因序列设计引物，从Th-33野生型菌株中扩增该基因加以验证。然后将该基因与农杆菌双元载体构建突变体产孢回复载体和根据该基因序列构建RNAi载体，通过ATMT方法分别进行突变株产孢特性的回复和RNAi技术沉默野生菌株产孢特性，验证该基因的功能，分析目标基因在木霉产孢过程中的表达和调控机制。本项目的研究结果对阐明木霉菌孢子形成机制和菌株遗传改造具有重要的理论和实践价值，同时对丝状真菌孢子形成机制研究具有重要的指导意义。

木霉菌是全球研究和应用最多的植病生防真菌，分生孢子是绝大多数木霉菌商品制剂的有效成分，木霉分生孢子的产率是其商业化成本的关键，也是木霉大规模推广应用的基础。研究木霉菌分生孢子形成相关基因，对阐明木霉菌产孢的分子机制和遗传改良具有重要的理论意义和应用价值，同时，对其它丝状真菌分生孢子形成机制研究具有积极的指导作用。项目研究团队前期采用ATMT方法建立了含有13000株突变株的哈茨木霉Th-33T-DNA插入突变体库，通过大量筛选，获得了2株产分生孢子显著减少的突变株1413和446。本项目以突变体1413为研究菌株，采用Tail-PCR技术，通过5次染色体步移（T-DNA插入点左侧3次，右侧2次）和序列拼接，经生物信息学分析，获得了一个插入点基因ThCon1，该基因全长3418 bp，共有5个外显子，4个内含子，开放阅读框长2904 bp，编码967个氨基酸。该氨基酸序列与Nectria haematococca mpVI 77-13-4的核染色质组装蛋白（chromatin assembly protein）有69%的相似性，含有两个保守的功能结构域WAC_Acf1_DNA_bd和DDT domain。采用RNAi干扰和基因敲除方法研究和验证该基因的功能，共构建了3干扰载体pDPH-RNAi1、pDPH-RNAi2和pSilent-CAP1及1个敲除载体pDHt/SK ThCon1：：hph。将构建好的3个干扰质粒电击转化野生型哈茨木霉TH-33，pDPH-RNAi1获得32个拟转化子，pDPH-RNAi2获得 8个拟转化子，pSilent-CAP1未获得转化子。PCR检测表明，pDPH-RNAi1和pDPH-RNAi2已成功转入哈茨木霉TH-33。表型分析表明，转化子从生长速率、产孢量、拮抗性能等方面与野生型无明显差异。利用根癌农杆菌介导pDHt/SK ThCon1：：hph转化哈茨木霉TH-33，共获得123株转化子。筛选出一株与野生型木霉菌TH-33相比产孢量明显下降的突变株。PCR检测表明该突变株ThCon1基因被敲除，与野生型相比，该ThCon1基因敲除突变株培养48h的速率生长降低了17.16﹪，培养5 d的产孢率减少93.87﹪。