竹红菌素合成代谢过程中关键酶快速分析平台的构建及应用研究

Hypocrellins have been mainly obtained from the stromata of Shiraia bambusicola which is a traditional Chinese herb. Hypocrellin has gained much attention, due to its multiple pharmacological effects, such as antitumor and antiviral. Because hypocrellin is a kind of secondary metabolism, its production is affected by nutrition sources and culture methods. This project will design a platform to analysis the characters of enzymes of hypocrellin synthesis. It will be used to analysis the key enzymes of hypocrellins biosynthetic pathway. Then, N-terminal sequence of key enzymes will be determined. And, primers will be designed to cloning and expression of these enzymes which physical and chemical properties will be studied to review the role of them in the biosynthesis process of hypocrellin . This project can help us understand the key enzymes of hypocrellin synthesis pathway and other similar pathway. It will provide the theoretical basis for improving the fermentation production and decreasing the by-products. At the same time, the project provides the informations for analyzing the biopathway of the similar compounds. In addition, the enzyme analyzing platform can be wildly used for other metabolism pathway analysis.

竹黄是我国的一种传统真菌中药，其主要活性成份竹红菌素作为重要的抗病毒、抗肿瘤化合物，在医药领域有着巨大的应用价值。竹红菌素是次级代谢产物，生物合成过程极易受到培养条件的影响；其代谢途径复杂，容易导致产量较低和副产物较多的问题。本项目将酶的色谱柱分离技术与酶不同底物的自动添加技术相结合，设计一种新型的竹红菌素合成代谢过程关键酶的分析定性平台,实现关键酶功能的快速定性；然后测定关键酶N端序列，设计引物，将之克隆表达并分析关键酶的理化性质，探究关键酶在竹红菌素代谢过程中的作用。通过构建酶快速分析定性平台，本项目为阐明竹红菌素合成代谢过程的关键酶功能及竹红菌素的合成调控奠定了理论基础，为提高竹红菌素产量及降低副产物量提供了技术支持；同时对于类似复杂醌类化合物的生物合成也具有重要的指导意义，所构建的酶快速分析定性平台可广泛应用于其它代谢过程的分析。

竹黄是我国一种传统真菌中药。其主要活性成份竹红菌素作为重要的天然光敏色素和抗病毒抗肿瘤化合物，在医药料等领域有着巨大的潜在应用价值。竹红菌素是次级代谢产物，因此，其生物合成过程广泛地受到培养条件的影响，不同培养条件下的相关酶的表达都会发生显著的差异。本研究采用基于现场总线控制技术、神经网络控制算法和粒子群智能优化算法，设计连续分离型超临界流体色谱仪的智能控制系统和优化操作条件，从而提高整个系统的自动化程度、分离效率以及产品的纯度和回收率。通过不同酶与底物的反应液，经超临界流体色谱分离，发现一种酶与蒽醌底物反应时，出现了苝醌类化合物的产物信号，N端测序，鉴定该酶为漆酶。通过不同培养条件下，RT-qPCR分析，确定了竹黄菌相对表达分析稳定可靠的内参基因。建立了竹黄菌高效表达系统，过表达了与竹红菌素合成相关的漆酶，竹红菌素产量提高了5倍，为3.18 g/L，同时对该漆酶进行了酶学性质研究。同时，本课题建立了CRISPR/Cas9敲除系统，并验证聚酮合成酶与单加氧化酶对竹红菌素的作用。该研究可使我们理解竹红菌素合成的关键酶和代谢机理，为其完整代谢途径的建立奠定理论基础，对于类似复杂蒽醌类化合物的生物合成也具有重要重要的指导意义，可为竹红菌素的稳定生物合成奠定理论基础。同时该项目也是我国传统中草药具有自主知识产权的创新理论研究。