基于烟草瞬时表达的萤火虫荧光素酶片段互补图像技术的研究及在水稻MAPKs和MAPKKs互作研究中的应用

萤火虫荧光素酶片段互补图像技术（LCI）是近年来形成的研究蛋白互作的新技术。基于烟草瞬时表达的LCI技术将LCI技术与烟草瞬时表达相结合，在研究植物蛋白的相互作用中，可以实现活体细胞内实时、定量分析；不受植物自发荧光的干扰；而且操作简单，不需要裂解细胞提取蛋白质，可以很好的反映植物生理条件下蛋白的互作状态。本项目从检测的灵敏度和某些蛋白特殊融合方向的要求出发，对这项技术进行了系统研究，并形成了Gateway技术的表达载体。从而拓宽了烟草瞬时表达LCI技术的检测范围，提高了这项技术的推广应用价值。水稻MAPKKs和MAPKs做为水稻MAPK级联反应的主要组成部分，在水稻对各种外源刺激反应的信号传导途径中起着重要的作用。因此本项目进而利用烟草瞬时表达LCI技术对水稻MAPKKs和MAPKs两个家族成员间的相互作用进行了全面系统的研究，为进一步解析水稻中的信号传导网络提供坚实的基础。

萤火虫荧光素酶片段互补图像技术（LCI）是最近形成的研究蛋白互作的新技术。基于烟草瞬时表达的LCI 技术（LCI-TET）将LCI 技术与烟草瞬时表达相结合，在研究植物蛋白的相互作用中，可以实现活体细胞内实时、定量分析；而且操作简单，不受植物自发荧光的干扰，代表了群体细胞中的结果。由于早期所使用表达载体的多克隆位点比较单一，当进行蛋白质互作验证时，构建待测基因的融合表达载体具有很多局限性，仅仅适合于2个待测蛋白互作的验证，不便于进行高通量蛋白质互作的筛选，影响了LCI技术的应用性。. 本课题针对LCI技术的局限性，从检测方法和表达载体的改造两个方面对LCI技术进行了进一步的优化，简化了LCI技术的操作性，拓展了LCI技术的检测方法，并利用LCI-TET技术研究了OsMAPKKs和OsMPKs家族成员间的互作关系。.LCI-TET中烟草瞬时表达的优化：首先筛选出了最适用的农杆菌菌株GV3101；农杆菌的培养则采用LB培养基；农杆菌注射烟草前用IM或MS-MES悬浮的效果比较好；在烟草瞬时表达中使用沉默抑制子P19可以明显的提高低灵敏度检测仪器的检测效果。. LCI-TET表达载体优化：成功改造了LCI技术的表达载体，构建了gateway目的载体（destination vector）pUC-Nluc-G、pUC-Cluc-G、pCAMBIA-Nluc-G和pCAMBIA-Cluc-G等表达载体。改造后的gateway目的表达载体可以如前期的表达载体一样用于检测蛋白质的互作，并且改造后的表达载体可以适用于高通量蛋白质互作的筛选。表达载体的优化不仅拓宽了LCI-TET技术的应用范围，而且提高了这项技术的推广应用价值。. OsMAPKKs和OsMAPKs家族互作研究：MAPKKs和MAPKs做为MAPK级联反应的主要组成部分，在各种外源刺激引起的信号传导途径中起着重要的作用。因此本课题进而利用LCI-TET技术对水稻MAPKKs和MAPKs两个家族成员间的互作进行了系统的研究。构建了MAPKKs家族中4个成员的氨基端融合表达载体，构建了MAPKs家族中13个成员的羧基端融合表达载体，验证了OsMAPKKs中3个成员与OsMAPKs中10个成员间的两两互作关系。筛选出强互作关系6对，弱互作关系4对，为进一步解析水稻中信号传导网络提供了坚实的基础。