葛根总黄酮诱导NB4细胞凋亡与JNK信号通路

The all-trans retinoid acid （ATRA） and the arsenic trioxide (ATO) as the highly effective treatments for targeting PML/RARα fusion protein. We have reported that Puerariae radix flavones (PRF), one of the main active constituents of Radix Puerariae, can induce the NB4 cells and the ATRA-resistant NB4-R1 cells to apoptosis which was related to JNK activation, presented synergetic effect combined with ATO. It is reported that JNK activation is necessary to induce APL apoptosis. Based on the NB4 cell lines and PML/RARα transgenic mice model, we will explore the effect of PRF on the JNK signal pathway in vivo and in vitro. Interrupting JNK pathway by pharmacological inhibitor (SP600125,a specific JNK inhibitor; z-VAD-fmk, a pan-caspase inhibitor）or genetic (siRNA) approaches displayed the effect of PRF on the role of the JNK signal pathway in NB4 cell apoptosis. The changes of PML/RARα in the ATRA-resistant cell line NB4-R1 treated with PRF in vitro may display the relationship between JNK and the retinoic acid receptor RARα indirectly.

维甲酸及三氧化二砷（ATO）靶向急性早幼粒细胞白血病(APL)特征性PML/RARα融合基因，使其成为第一种可以治愈的急性白血病。课题组前期实验发现葛根主要活性成分葛根总黄酮（PRF）诱导APL维甲酸敏感株NB4、耐药株NB4-R1细胞凋亡，与ATO具有协同作用；PRF诱导的NB4凋亡与JNK活化相关。文献报道JNK是APL细胞凋亡不可或缺的信号分子。本项目以NB4为研究对象，在成功建立相关细胞模型及PML/RARα转基因小鼠模型的基础上，进一步研究PRF在体内外对JNK相关信号分子谱ASK1、MKK4/7、TNFR、Bcl2等的影响；JNK、caspase抑制剂、靶向JNK的siRNA体外阻断JNK及caspase级联活化，观察PRF对NB4凋亡中JNK信号通路的影响；PRF干预维甲酸耐药细胞株NB4-R1，观察PML/RARα及JNK相关分子表达变化，间接证明与维甲酸受体的可能关系。

葛根总黄酮（PRF）是中药葛根的黄酮提取物，被证实具有潜在的抗肿瘤作用。本课题组既往的研究证实PFR诱导多种白血病细胞株凋亡，以急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞为著，其分子机制可能与JNK磷酸化有关。因此，本研究按国自然标书计划，采用JNK抑制剂及caspase抑制剂等进一步探讨了JNK信号活化对PRF诱导NB4细胞凋亡的影响及分子机制。结果显示10~50μg/ml PRF诱导NB4细胞凋亡，JNK磷酸化明显增强，JNK下游蛋白c-Jun磷酸化增强，证实了JNK信号通路在凋亡过程的激活；联用JNK抑制剂能部分逆转高浓度PRF的作用，但对低浓度PRF能增强凋亡作用，提示高浓度PRF通过活化JNK，激活下游线粒体凋亡途径诱导凋亡，而低浓度PRF诱导的JNK弱表达可能与细胞增殖有关。以10~50μg/ml PRF处理维甲酸耐药细胞株NB4-R1，证实PRF能有效抑制NB4-R1细胞株增殖，PRF干预引起JNK活化的同时伴cyclinA、CDK2明显下调，与维甲酸受体无关。其作用机制除了JNK信号的激活外可能还与细胞周期阻滞有关。此外，我们还发现p38信号是NB4细胞凋亡抵抗的可能机制，联用p38抑制剂能增强凋亡信号表达；而联用ERK抑制剂对PRF诱导凋亡作用并没有影响。鉴于caspase抑制剂不能完全阻断PRF诱导NB4细胞的凋亡，我们进一步检测了PRF对NB4细胞自噬可能的影响及相关机制，结果显示PRF干预同时引起了NB4细胞自噬水平升高，而且自噬表达性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 水平在30μg/ml PRF最高。采用30μg/ml PRF联合3-MA组凋亡相关蛋白PARP、caspase表达增加，而联合雷帕霉素组凋亡降低。提示PRF干预NB4细胞自噬可能是一种保护机制，但自噬作为一种大分子蛋白降解的主要方式，其表达升高也可能与PML-RARα融合蛋白降解有关。课题组采用10μg/ml PRF 0~48小时时间梯度干预NB4细胞发现Beclin1表达在12小时达高峰，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 表达水平在24小时达峰值，这可能与细胞增殖周期有关。本课题较确切的阐明了中药葛根有效成分PRF对APL细胞的诱导凋亡作用及分子机制，肯定了PRF对APL的治疗中的价值，为PRF的临床试验和应用提供了更为确凿的研究基础和依据。