环介岛等温基因扩增过程的电化学信息研究

高特异性的环介岛等温基因扩增（LAMP）技术解决了基于核酸的分子生物学研究的诸多难题，其与高灵敏度的电化学检测技术的结合将使得现场、低费用生物分析成为可能，本项目将研究这种结合的理论与应用基础。.项目拟先构建出几何参数适用、高重现性、高灵敏的电化学传感器体系，其次建立环境监测代表微生物- - 大肠杆菌（E. coli）中特征基因片段的LAMP方法。在此基础上，系统研究LAMP扩增体系中内源反应物分子的伏安行为、电极机理以及其伏安参数随扩增反应进展而产生的变化。接着遴选出指示信标分子，探索其电化学响应与LAMP扩增即时结果（产物量）间的关系，进而得到相应反应条件下信标分子伏安响应值与DNA初始模板量间的内在联系。最后，构建一种快速基因分析新模式- - 通过电化学实时监测LAMP进程中信标分子的变化量来反演DNA初始模板定性、定量信息。

高特异性的环介导等温基因扩增（LAMP）技术解决了基于核酸的分子生物学研究的诸多难题，其与高灵敏度的电化学检测技术的结合将使得现场、低费用基因分析成为可能，本项目研究了这种结合的理论与应用基础。. 项目的第一阶段按照两条主线展开。其一，建立了E. coli中特征基因片段的LAMP方法，确定了各项实验参数，借助传统的电泳法和荧光染料法，表征了扩增效果。拓展研究表明：常用的染料之一——钙黄绿素指示LAMP反应进度灵敏度较低的重要原因是其与生成物dsDNA相互作用。其二，研制并表征了柱面玻碳、碳纳米管阵列电极、导电碳黑糊电极和石墨烯糊电极四种工作电极，结果表明，它们的伏安分析性能与被分析对象性质相关。针对LAMP扩增反应系统中各种电活性物质的分析，碳纳米管阵列电极表现出最好的灵敏度与稳定性。. 项目的第二阶段研究了LAMP扩增反应系统中各种电活性物质在碳纳米管阵列电极上的电化学行为，结果表明dGTP具有最灵敏的电化学活性，适于作为标识分子。进一步研究发现成功的LAMP反应将dGTP组构进产物dsDNA中去，造成其浓度降低，进而引起电流响应值的降低，因此可以通过伏安测定dGTP来指示生化反应结果。据之建立了一种通用性好、响应快、廉价的LAMP结果分析新方法。. 本项目还初步研究了LAMP生化过程中反应混合液电导的变化规律，结果表明：随着dsDNA的生成，反应混合液的电导将有规律下降，这给了我们一个非常有价值的启迪——采用非接触电导传感器监测LAMP过程将既可秉承伏安法的优点，还能确保实时监测封闭反应管中基因扩增进展（即像光学方法一样每一刻的结果自动“可见”），因而使得构建更理想基因分析技术成为可能。