树蛙皮肤中潜在药用多肽/蛋白的结构与功能研究

Acquired immune system in amphibians is very fragile.In view of this,it depends on the innate system that is mainly composed of different kinds of defensive peptides and proteins in amphibian skins,the anmphibian skins are key components of the innate immune system of amphibian, and are extensively involve in regulating of nervous system,blood system and immune system.These peptides and proteins are the first line of defense against viral infection upon all amphibian life stages.Therefore,reseach on the skin of frog are hot topic to discover some candidates for therapeutic drugs.Three cDNAs encoding antimicorbial pepptide precursor and two cDNAs encoding serine protease inhibitor precursor have been cloned from the skin of treefrog by us.Blast search results show that they have 55-59% indentities with other amphibians.Based on these work,we hope to characterize the transcriptome of the skin of treefrog,as well as to investigate the structure and function of these novel peptides and proteins, this would help to a better understaning of the molecular mechanism how they could defense potential predators, pathogens, or nonbiological injuries.The further research may lead to discoveries of novel potential lead molecules for pharmaceutical drugs.

两栖动物的获得性免疫系统比较脆弱，主要依靠先天免疫系统（多种防御多肽和蛋白组成）承担着抵御环境中各种微生物侵袭的第一道防线，这些防御多肽和蛋白广泛参与神经系统、血液系统和免疫系统等生理功能的调节。因此，科研人员一直致力于从两栖动物皮肤中筛选活性多肽和蛋白作为药物候选分子。我们从云南特有物种普洱泛树蛙皮肤cDNA文库中克隆了3条新颖的抗菌肽和2条蛋白酶抑制剂cDNA序列，BLAST比对结果表明，这5个多肽的一级结构与其它蛙科两栖动物中的类似物同源性很低（55-59%），下一步我们拟测定该树蛙皮肤转录组信息，比对分析后筛选一些结构新颖的多肽/蛋白进行合成/表达，系统开展树蛙防御多肽/蛋白的高级结构和分子机制等方面的研究工作，进而从中挖掘一些具有潜在药用价值的先导分子，为建立我国动物来源药用资源体系奠定基础。

两栖动物有着极强的生存策略以适应不同的栖息环境。它们的皮肤分泌液中富含多种免疫调节防御分子以应对环境中的各种不利因素。我们以云南特有物种普洱泛树蛙为研究对象，提取皮肤mRNA进行转录组测定。根据获得的转录组信息，我们在NCBI基因功能注释数据库中筛选了35种免疫调节蛋白/多肽的编码基因（Andersonin、Defensin和Cathelicidin家族抗菌肽，Serpin和Kunitz家族蛋白酶抑制剂等），这些序列与数据库中相应分子的相似度介于32.3-90.9%之间。此外，我们还发现了48种具有可分泌信号肽然而功能未注释的编码基因。.我们从普洱泛树蛙皮肤分泌物中分离纯化了3种宿主防御肽/免疫调节多肽（PopuDef, Cathelicidin-PP和PopuCATH）并完成了结构分析以及其抗菌、抗炎、免疫趋化的分子机制研究。这些分子能够破坏细胞膜完整性，抑制革兰氏阳、阴性菌和真菌的生长，它们在磷脂膜或疏水环境中主要为β折叠构象。此外，Cathelicidin-PP和PopuCATH能够强烈的抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。这些特性部分解释了普洱泛树蛙在感染时如何应对机体的炎症反应。此外，我们还纯化得到1种具有强烈抗氧化活性的多肽Antioxidin-PP，它能够快速清除ABTS+和DPPH+自由基和 HaCaT细胞中活性氧簇，目前正进行机制研究。PopuDef和Cathelicidin-PP这2个分子的基因和应用均已申请国家发明专利，其中PopuDef已授权（专利号：ZL 201410288772.X）；Cathelicidin-PP尚在处理中（申请号：201710105882.1）。PopuDef和Cathelicidin-PP的研究数据以通讯作者分别发表于Amino acids（2015, 47:1301-8和2017,86:1230-1），另有2篇撰写中（PopuCATH和Antioxidin-PP）。.这些调节多肽/蛋白的序列鉴定及分子机制研究，初步解释了普洱泛树蛙的生存策略，即如何对抗生态环境中的不利因素得以长期生存和繁衍（如微生物侵袭后的高效快速杀菌和抗炎，紫外线照射后的皮肤保护和皮肤损伤后的快速修复等。此外，鉴定的这些防御肽、调节多肽/蛋白序列信息可为后续开发利用相应功能的潜在药物提供分子模板。