从OPN介导的巨噬细胞与滑膜细胞相互作用探讨骨关节炎发病的分子机制

Osteoarthritis (OA) is a chronic degenerative joint disease that is critical to human health. The core pathological changes include macrophage secretion of inflammatory factors, hyperplasia of synoviocytes , apoptosis of chondrocytes. So,OA is a multi-tissue involved, multi-cell interacted process. Osteopontin (OPN) is an important factor in the course of OA.We find that OPN is elevated in synovial fluid and correlated with the severity of the disease. Moreover, OA-induced pathogenic hypoxia activates macrophages to secrete OPN. OPN target binds to synoviocyte membrane receptors CD147, causing synovial cell proliferation and extracellular matrix deposition,which further increases hypoxia in the articular cavity. Combined with previous literature, we propose hypotheses: OPN-mediated macrophage activation and synoviocyte proliferation results in a malignant loop which promotes the development of OA. In this study, macrophage-synoviocyte co-culture system and monocyte-macrophage-specific OPN knockout mice were used to validate the hypothesis in vitro and in vivo to explore the intercellular relationship and mechanism, and to clarify the effect of this crosstalk in the pathogenesis of OA.This study will provide the OA treatment with new theoretical basis and treatment strategies.

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种严重危害人类健康的慢性、退行性关节病变。其核心病理改变包括巨噬细胞分泌炎症因子，滑膜细胞异常增生，软骨细胞凋亡等，是一个多组织受累，多细胞互相作用的过程。骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）是OA病程中的重要因子。课题组前期研究发现：滑液中OPN升高且与OA严重程度相关；低氧激活巨噬细胞，使其分泌OPN；OPN能靶向结合滑膜细胞膜受体CD147，致滑膜细胞增生和细胞外基质沉积，可加重关节腔低氧。结合文献，我们推测：OPN介导的巨噬细胞激活和滑膜细胞增生形成的恶性环路将促进OA发生发展。本研究拟通过巨噬细胞-滑膜细胞共培养体系和单核巨噬细胞特异性OPN敲除小鼠，在体外细胞与活体动物两个层面验证此假说，探索两种细胞间的相互联系及作用机制，并阐明这种联系在OA发病中的效应，为OA的治疗提供新的理论依据和防治策略。

骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种严重危害人类健康的慢性、退行性关节病变，其核心病理改变包括巨噬细胞分泌炎症因子，滑膜细胞异常增生，软骨细胞凋亡等。骨桥蛋白（Osteopontin, OPN）是OA病程中的重要因子，可由包括巨噬细胞、滑膜细胞以及软骨细胞在内的多种细胞分泌。本研究首先探讨了OPN与OA软骨细胞之间的调控关系，发现OPN与OA软骨细胞的自噬相关，为进一步研究OPN是否影响OA软骨细胞的自噬及影响机制，首先比较了人OA和正常软骨的自噬水平。然后，体外培养人OA软骨细胞，用重组人OPN（rhOPN）处理细胞，以确定自噬的变化。并利用抗CD44和抗cd51/61单克隆抗体（Abs）或同型IgG来确定CD44和avb3整合素可能的作用；随后使用ERK/MAPK通路的抑制剂来研究ERK/MAPK的作用。Western blotting检测Beclin1、LC3II和MAPK蛋白表达，mRFP-GFP-LC3共聚焦成像和透射电镜检测自噬水平。CCK-8检测软骨细胞增殖和活性。为进一步验证骨关节炎中OPN介导的巨噬细胞与滑膜细胞相互作用机制，本研究拟通过比较OA患者与健康人的实验标本（软骨组织、滑膜组织）及原代分离的滑膜成纤维细胞中OPN及各炎症因子的表达、巨噬细胞激活状态，验证OPN与巨噬细胞、滑膜细胞和软骨细胞三者之间的关联性。并通过共培养体系结合shRNA等方法研究巨噬细胞激活与滑膜细胞的相互作用，对细胞功能的影响，及对OPN及其受体、通路因子表达和炎症因子分泌的影响。联合OPN与CD147-shRNA慢病毒或PI3K/AKT通路抑制剂干预阐明OPN对滑膜细胞增殖与炎症因子分泌的调控作用是否通过CD147和PI3K/AKT实现，并利用免疫共沉淀实验探明 OPN与CD147结合的分子机制。构建OPN慢病毒敲除小鼠，并通过DMM法构建OA小鼠模型，并用M1巨噬细胞特异启动子的OPN干扰病毒和OPN中和抗体分别处理OA模型，观察小鼠关节内软骨、滑膜的病理改变；并在滑膜细胞内沉默CD147，同时用OPN重组蛋白处理，检测OPN和炎症因子等指标的改变，明确OPN介导巨噬细胞和滑膜细胞相互作用对OA发病的影响。旨在从全新的视角揭示OA发病机理，探索新的生物学干预靶点，为临床防治OA提供新思路。