SbRFP1基因调控马铃薯块茎低温糖化的分子机制研究

RING finger genes are widely existed in eukaryotes, and response to various biotic and abiotic stresses. We first found the regulatory role of RING finger gene SbRFP1 in the process of potato cold-induced sweetening (CIS) earlier. And SbRFP1 is likely to play a role by regulating the starch degradation. In this project, the metabolic pathways regulated by SbRFP1 at transcription level will be elucidate by sequencing the transgenic and control tubers treated with low temperature, and analyzing the change of metabolic components in transgenic tubers. The interaction proteins of SbRFP1 and the interaction molecular mechanism will be expatiated at the protein level, using the yeast two hybrid、GST-Pull down、site directed mutagenesis. Combined with the determination of ubiquitin ligase activity, the regulation pattern of SbRFP1 will be clear. This study will reveal the molecular mechanism of SbRFP1 in regulating potato CIS, and also provide theoretical basis and important technical guarantee for enhancing potato improvement for processing quality.

RING finger基因广泛存在于真核生物中，对多种生物非生物胁迫具有调节作用。前期，我们首次发现了在马铃薯块茎低温糖化过程中起调节作用的RING finger基因SbRFP1，初步判断SbRFP1可能是通过调节淀粉降解途径发挥作用。本项目拟通过对低温处理的转基因块茎高通量测序，结合转基因块茎中代谢组分的变化，明确SbRFP1在马铃薯块茎中调控的代谢途径。还将利用酵母双杂交或者GST－Pull down技术捕获SbRFP1的互作蛋白，通过对SbRFP1泛素连接酶活性的测定和互作位点分析，明确SbRFP1与互作蛋白的互作模式和调控方式。本研究不仅揭示了SbRFP1调控马铃薯块茎低温糖化的分子机制，还为马铃薯加工品质改良提供重要的理论基础与技术保障。

马铃薯块茎低温糖化严重影响块茎的采后品质，前期研究发现马铃薯RING finger 基因SbRFP1可以有效控制还原糖的累积。为了明确SbRFP1基因发挥作用的方式，本研究通过代谢组和转录组分析其调控的代谢途径，通过互作蛋白的研究明确基因发挥作用的方式。转基因株系和对照块茎中代谢组分分析显示，超量转基因块茎中淀粉和蔗糖含量升高，葡萄糖和果糖含量降低，干涉转基因株系块茎中则相反，说明SbRFP1可能是通过影响淀粉的降解和蔗糖的分解控制还原糖的积累。但是转录组差异表达基因中并没有富集淀粉-糖代谢途径中的基因，说明SbRFP1对淀粉降解和蔗糖分解的调控可能是转录后水平的调控。通过酵母双杂交和免疫共沉淀方法捕获互作蛋白并对潜在互作蛋白验证发现，SbRFP1与淀粉降解过程中的α-淀粉酶StAmy23、β-淀粉酶StBAM1和淀粉分支酶SBEⅡ互作，酶活性实验结果表明SbRFP1对StBAM1活性具有明显的抑制作用。同时泛素连接酶活性结果表明SbRFP1蛋白具有泛素连接酶E3的活性，并且第140位的组氨酸与第150位的半胱氨酸起着关键作用。以上结果说明SbRFP1可以通过蛋白互作降解β-淀粉酶StBAM1从而降低淀粉酶的活性，控制块茎中淀粉向还原糖的转化，有效控制还原糖的累积。另外，转录组差异表达基因中存在胁迫相关的基因，利用组培苗进行盐胁迫实验发现SbRFP1基因可以减缓盐胁迫对马铃薯植株的伤害。