印记基因PHLDA2调控骨肉瘤放疗增敏作用及机制研究

Radiation resistance may be a predominant factor with poor efficacy of osteosarcoma therapy.Apoptosis-related genes can affect a tumor's response to radiation,however the role of apoptosis-related imprinted genes in radiosensitivity is unresolved. Our previous studies have shown that the imprinted gene PHLDA2 may be a pro-apoptotic factor in osteosarcoma,and the expression may be associated with increased radiation response.Literatures indicate that the PH domain of PHLDA2 binds to PIP site competitively with Akt.We therefore hypothesize that overexpression of PHLDA2 may contribute to increase the sensitivity of radiation in osteosarcoma,which is achieved by synergistic inhibition of Akt with X-Ray.In this research,the corelation between PHLDA2 and radiation response has been investigated in osteosarcoma specimens,cell lines and animal models, meanwhile the molecular mechanism of radiosensitivity has also been studied.The aim of this study is to clarify the effect of PHLDA2 overexpression on increasing the sensitivity of radiation and the relative mechanism, which can provide a new target to predict the radiation response of osteosarcom,and also provide some new experimental basis for enhancing radiasensitivity by targeted some genes.

骨肉瘤的放疗抵抗是制约其疗效提高的主要因素。凋亡相关基因影响辐射敏感性，但凋亡相关的印记基因在肿瘤放疗增敏中的作用尚不清楚。我们前期研究发现，印记基因PHLDA2在骨肉瘤中发挥促凋亡作用，其表达水平与放疗疗效正相关；结合文献报道，PHLDA2的PH结构域能与Akt分子竞争性结合PIP位点。我们推测，上调骨肉瘤中PHLDA2印记基因的表达增加骨肉瘤细胞的放射敏感性，其敏感性的增加是通过与X射线协同抑制Akt蛋白的激活实现的。本研究拟采用Tet调控的真核表达载体技术，在骨肉瘤大体标本、细胞株及动物模型上，观察PHLDA2表达与放疗疗效的相关性，并对PHLDA2基因增敏放疗的分子机制进行研究，以期阐明上调PHLDA2基因表达的辐射增敏作用及相关的增敏机制，为预测骨肉瘤的放疗疗效提供有用的分子靶点，同时为基因靶向的辐射增敏治疗提供部分新的线索和实验依据。

骨肉瘤(osteosarcoma)是一种高侵袭性的骨原发性恶性肿瘤，虽然多种治疗手段的综合运用使骨肉瘤的疗效较前有所提高，但仍有30%～40%的患者因局部复发或远处转移而导致治疗失败。研究证实，术后瘤床内残留的恶性细胞是骨肉瘤复发、转移的根源，辅以手术的放射治疗能有效的提高局部控制，使手术时肿瘤播散的风险下降，但骨肉瘤细胞的辐射抗性制约了放射治疗的临床应用。凋亡相关基因影响辐射敏感性，但凋亡相关的印记基因在骨肉瘤放疗增敏中的作用尚不清楚。我们前期研究发现，印记基因PHLDA2在骨肉瘤中发挥促凋亡作用，其表达水平与放疗疗效正相关；结合文献报道，PHLDA2的PH结构域能与Akt分子竞争性结合PIP 位点。因此本研究假设，上调PHLDA2印记基因的表达增加骨肉瘤细胞的放射敏感性，其敏感性的增加是通过与X射线协同抑制Akt蛋白的激活实现的。针对这一具体课题，本项目以骨肉瘤大体标本、细胞株及动物模型为研究对象，首先观察PHLDA2表达与放疗疗效的相关性；并对PHLDA2基因增敏放疗的分子机制进行研究。研究结果包括：.1.去甲基化制剂(5-Aza-CdR)通过逆转印记基因PHLDA2启动子区的高甲基化表型上调PHDLA2表达，从而介导人骨肉瘤细胞的辐射增敏作用；.2.稳定高表达PHLDA2基因通过增强Caspase-3的活性、促进射线诱导的细胞凋亡，显著增加骨肉瘤细胞和裸鼠移植瘤对X射线的敏感性；.3.印记基因PHLDA2在骨肉瘤组织中表达下调，其表达可作为放疗疗效评估的参考指标； .4.骨肉瘤组织中miR-214高表达，miR-214靶向PHLDA2-3’UTR，发挥对PHLDA2基因的负性调控作用；.5.过表达miR-214调控靶标基因PHLDA2/AKT信号通路，进而介导骨肉瘤细胞的辐射抵抗效应。.本研究从miRNA层面阐明PHLDA2基因的上游调控机制，并阐明骨肉瘤中上调印记基因PHLDA2表达的辐射增敏作用，进一步证实其增敏作用是通过miR-214/PHLDA2/AKT信号通路介导的，其为预测骨肉瘤的放疗疗效提供有用的分子靶点，同时为基因靶向的辐射增敏治疗提供部分新的线索和实验依据。