Bacillus amyloliquefaciens LZN01抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌的机制

Fusarium wilt is caused by Fusarium oxyxporum f. sp. niveum (FON), which restricts severely production of watermelon. We screened and isolated a strain from wheat rhizosphere against Fusarium oxyxporum f. sp. niveum (FON), which has named as Bacillus amyloliquefaciens LZN01. However, the mechanisms of Bacillus amyloliquefaciens LZN01 against FON is still unclear. Therefore, this project will focus on: (1) to isolate and identify of antifungal bioactive components from Bacillus amyloliquefaciens LZN01 against FON using chromatography and ESI-MS/MS technology etc; (2) to study the morphological responses of FON cells when they are exposed to antifungal bioactive components from Bacillus amyloliquefaciens LZN01 using Scanning and Ttransmissing electron microscopy; (3) to study biological behavior of antifungal bioactive component on plasma membrane of FON using Sytox Green (SG) uptake assay, fluorescence microscopy and Calcein leakage assay; (4) to explore the mechanism of antifungal bioactive components entering FON cell using low temperature, NaN3 and various endocytosis inhibitors treatment. The project is expected to reveal the mechanisms of how the antifungal bioactive components to inhibit FON. Overall, this study can provide theoretical foundation for biocontrol of Fusarium wilt in watermelon, and offer some the new resource and approaches for development and application of biocontrol agents.

西瓜枯萎病由西瓜专化型尖孢镰刀菌（FON）引发，严重制约西瓜的生产。申请者从小麦根际筛选出高效抑制FON的生防菌株Bacillus amyloliquefaciens LZN01，但其抑菌机制不明。本项目（1）运用层析和电喷雾串联质谱等技术，分离和鉴定Bacillus amyloliquefaciens LZN01抑制FON的活性成分；（2）利用电子显微技术，研究FON暴露在抑菌活性成分下的形态响应过程；（3）采用Sytox Green吸收分析，荧光显微技术和Calcein释放实验，阐释抑菌活性成分在FON质膜微界面上的生物学行为；（4）通过低温、叠氮钠和内吞作用抑制剂实验，揭示抑菌活性成分细胞内化的机制。通过该研究试图揭示Bacillus amyloliquefaciens LZN01抑制FON的机制，为生物防治西瓜枯萎病提供理论依据，并为生防制剂的开发与利用提供新的资源和途径。

西瓜枯萎病是西瓜连作障碍的主要因子之一，成为制约西瓜可持续发展的瓶颈。利用有益微生物及其代谢产物抑制病原菌的生存和活动，是控制病害的有效方法。本研究采用UHPLC-LTQ Orbitrap MS技术分析Bacillus amyloliquefaciens LZN01上清液的抑菌成分，发现myriocin、sphingofungin E、sphingofungin F、sphingofungin C是主要的抑菌活性成分；myriocin在上清液中的浓度为0.6 µg/mL，最小抑菌浓度是1.25 µg/mL，myriocin降低了Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon)膜的流动性，破坏了Fon膜的完整性。在显微镜下观察到孢子缩小、液泡变大、电子密度不均匀等显著的形态学变化。转录组学和蛋白质组学分析也支持膜靶向作用机制，一共鉴定出560个共同差异表达基因(DEGs)和285个共同差异表达蛋白(DEPs)，结合转录组学和蛋白质组学分析表明，myriocin破坏了与鞘脂代谢、甘油磷酸脂代谢、甾体生物合成、ABC转运体和内质网蛋白加工相关的代谢，同时，myriocin破坏了丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）活性，说明myriocin诱导了Fon膜损伤。DNA结合和荧光光谱分析表明，myriocin可以与Fon细胞的dsDNA相互作用。转录组学和蛋白质组学分析也支持细胞内靶向作用机制，共鉴定2238个DEGs，多数DEGs在功能上归属于代谢和遗传信息处理，并在真核生物的核糖体生物发生过程中富集，在真核生物的核糖体生物发生过程中，一些基因和蛋白的表达受到myriocin的影响，主要涉及到C6锌簇转录因子家族和NFYA转录因子控制的基因；另外，myriocin增加可变剪接事件发生，靶标真核生物核糖体生物源途径上的关键基因（FOXG_09470）和蛋白（RIOK2）；低温、叠氮钠和内吞作用抑制剂实验表明，myriocin进入Fon孢子内部需要能量，同时有囊泡运输参与的内吞作用。本研究为Bacillus amyloliquefaciens防治西瓜枯萎病提供了理论依据，并为生防制剂的开发与应用提供了新的菌种资源。