冷压力激活玉米串联重复序列的细胞遗传学研究

Based on the previous studies, we will analyze the expression of Knob tandem repeats in maize roots, shoots and leaves by using Northern blot and RT-PCR. Following treatment with inhibitors of epigenetic enzymes and cold stress, the epigenetic modification status will be comparatively analyzed by ChIP-PCR and Bis-Seq. 3-Inmmuno-FISH will be used to map these DNAs in nuclei, determine their relationship with chromatin center and loops, detect the status of chromatin condensation and decondensation, and understand possible association with chromatin modifications and HP1 after cold treatment. Following treatment with inhibitors of epigenetic enzymes, ABA and cold stress, the expression time course of knob repeats and a series of cold responsive transcription factors will be studied by RT-PCR and the possible action between knob repeats and these factors will be further analyzed by ChIP with antibodies against theses factors. RNA in situ hybridization will be applied to localize the RNAs expressed by knob repeats in nuclei and RT-PCR and Southern blot will be used to detect copies of these tandem repeats and formation of extrachromosomal DNAs after cold treatment. These studies will elucidate the possible association of nucleus location, chromatin structure and function of these repeats and illustrate regulation mechanism of Knob tandem repeats at chromatin levels in maize during cold acclimation,which will lay a foundation for maize breeding based on the repetitive sequences.

在前期工作基础上，用Northern blot和RT-PCR研究Knob串联重复序列在冷处理的玉米不同组织中的表达。用染色质修饰酶抑制剂和冷处理玉米，ChIP-PCR和重亚硫酸盐测序技术分析Knob染色质修饰状况的变化。用3D-Immuno-FISH方法在间期核定位重复序列确定它们的核空间分布、与染色中心和环的位置关系、染色质浓缩和脱浓缩状况及与不同染色质修饰和相关蛋白的联系。利用RT-PCR分析Knob序列和冷反应转录因子基因如ZmDREB1等随时间的表达和转录因子免疫沉淀-PCR研究转录因子和Knob序列之间的关系。RNA原位杂交分析Knob序列的RNA在间期核中的分布, RT-PCR和Southern blot分析冷压下重复序列拷贝数或染色体外DNA的形成。本研究试图阐明这些序列在染色质水平上的表达机制，将加深人们对玉米基因组重复序列的认识，为玉米基于重复序列的抗性改良奠定理论基础。

玉米是一种重要的经济作物，也是植物核基因组细胞遗传学研究的模式生物。玉米基因组比较大，含有约85%的重复序列。目前关于这些重复序列如Knob序列在植物生长发育和逆境反应中的功能以及细胞遗传学基础知之甚少。本研究是关于冷压力激活Knob串联重复序列的细胞遗传学和染色质调节机制。在这个研究中，我们成功设计了专一性引物并通过RT-PCR扩增得到TR-1序列，发现在冷压力下Knob TR-1表达升高且在叶片中表达明显高于根，结合ABA和冷压力作用下，利用TR-1探针FISH发现染色质发生脱浓缩，发现组蛋白H3K9、H4K5乙酰化上升以及H3K9二甲基化下降，证明Knob串联重复序列可能通过组蛋白表观修饰变化影响染色质的脱浓缩，进而调控Knob重复序列的转录。结合冷和激素处理分析冷反应转录因子ZmICE1和ZmDREB1以及TR-1的转录变化，推测Knob转录产物可能通过ZmICE1/ZmDREB1信号途径参与玉米冷应激反应。同时发现热处理也能引起玉米Knob TR-1的转录上调。另一个串联重复序列45S rDNA在热压力下染色质发生脱浓缩，ChIP分析显示在启动子区域H3K4me2和H3K9ac的修饰发生变化，说明植物重复序列在胁迫下表达上调，并且染色质修饰参与了这一过程。表观修饰酶类抑制剂如TSA、5-AC、OA、H89以及NaB可能通过增加活性氧的形成，抑制DNA拓扑异构酶基因表达的而引起细胞周期前期停滞。同时我们还发现组蛋白去乙酰化酶(HDACs)参与调节玉米糊粉层中活性氧(ROS)相关基因的表达并且是GA通过ROS介导玉米糊粉层程序性细胞死亡过程所需要的，并且证实组蛋白乙酰化能够介导GA调控的45S rDNA染色质脱浓缩。通过研究表观修饰动态变化与细胞周期的关系以及在逆境胁迫下对基因和串联重复序列转录的影响，不仅扩展了植物表观遗传学的研究内容，也将加深人们对玉米作物基因组结构和功能尤其是大量的重复序列的认识以及作物抗性机理的了解，同时也为玉米基于重复序列和染色质修饰上的抗性改良奠定基础。