多链嵌合抗原受体CAR的设计与研究

Chimeric antigen receptor T cells (CAR-T) have been marketed in the United States for their high complete response rate to hematoma. Although China generally lags behind the United States in the whole fields of biomedicine, China is following the United States in CAR-T field. Thus, increasing CAR-T research support will help us taking the lead in this field. Although CAR-T has initially shown good prospects for treating solid tumors, the efficacy is less ideal. According to the theory of immune receptor activation that micro-clustering of receptors is necessary for receptor activation, TCR complex assembly is mainly determined by the transmembrane domains of TCR and CD3, and there are up to 10 immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAM) in the intracellular tails of TCR complex. The ITAMs in TCR may deliver a more comprehensive signal than the current CAR (only contains 3 ITAMs). Therefore, here we plan to replace the transmembrane domain of the current CAR with the transmembrane domains of TCR (α, β), CD3 (ζ, γ, ε and δ), and study which of these modified CARs can form a multi-chain complex with endogenous TCR, and which show a best T cell signal activation and killing efficacy. Thus, in this proposal, we intend to find a new transmembrane domain of CAR that maximizes the T cell efficacy and improves the therapeutic benefit of CAR-T for solid tumors.

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）以其对血液瘤较高的完全缓解率已经在美国上市。虽然我国在生物医学领域总体上落后于美国，但是在CAR-T领域我国的发展却紧跟美国的步伐，加大支持力度有利于我们实现超越。尽管CAR-T对实体瘤治疗也初步显示了良好前景，但是还不够理想。根据免疫受体活化的理论即受体微簇体化是受体活化的必要条件，以及TCR复合体组装主要由TCR和CD3穿膜区决定，加上TCR复合体有多达10个免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）可能会比CAR（含3个ITAM）传递更综合的信号。因此，本研究项目拟利用TCR或CD3的穿膜区替换现有经典CAR的穿膜区，分析携带TCR(α,β), CD3(ζ,γ,ε和δ)穿膜区的CAR与内源TCR形成多链复合体的程度，以及所导致的T细胞信号活化、杀伤效果等指标，找到可使T细胞效应最大化的CAR穿膜区，以期待改进后的CAR改善对实体瘤的治疗效果。

CAR-T技术已经取得较好的应用成效，然而我们对CAR-T以及基于TCR的CAR的信号活化机制认识尚且不足，本研究针对这些问题开展。主要研究内容：构建NF-κB和NFAT信号报告系统，构建分别携带TCR-CD3复合体TCRα, TCRβ, CD3ζ, CD3γ, CD3ε, CD3δ穿膜区的CD19 二代CAR，搭建用于分析CAR免疫突触与成簇的人工脂双层抗原递呈系统，构建研究CAR机械拉力基于短双链DNA的力学检测系统，初步分析了CAR活化是否需要机械力以及与其大小的关系，对比研究TCR-CAR与常规CAR被机械力激活的效应差异，分析CAR在抗原未结合与结合态下的运动速率，以及与其他团队合作开展体外微流控实体瘤组织培养体系中CAR-T效应评价。重要结果与关键数据：成功构建了用于CAR信号活化研究的NF-κB和NFAT信号报告系统、脂双层抗原递呈系统、机械力研究系统；构建了以TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ穿膜区替换二代经典CAR穿膜区的CAR，发现只有携带CD3γ穿膜区的CAR可以正常上膜；构建了TCR缺失的Jurkat细胞系；证明了CAR信号受到机械力的影响，56pN的机械力可以激活CAR信号；TCR-CAR被机械力激活的能力可能与常规CAR类似；CAR在抗原结合后扩散速率变慢，且与信号是否活化无关；在体外血管化实体瘤球体组织培养体系中完成了CAR-T效应评价研究，为CAR-T研究提供了介于体外培养皿培养研究体系与临床研究的过渡，为小鼠体内研究提供了替代方案。综上，本项目的研究大大加深了我们CAR以及TCR-CAR信号起始与活化的认识，为CAR的新设计提供了理论支持。