丙酮酸激酶同工酶2（PKM2）在心肌肥厚中的作用及其机制研究

The glycolytic rate-limiting enzyme (PKM2) is a key downstream target molecule of the mTOR and highly expressed in cardiac hypertrophy. In other studies it was found that PKM2 is involved in the expression of cardiac hypertrophy-regulated genes. PKM2 is compensatory overexpression in hypertrophic myocardium, but its role in the pathological process of Cardiac hypertrophy remains unknown. Whether the role of PKM2 on cardiac hypertrophy depends on the mTOR pathway is unclear. Accordingly, we put forth the following specific aims to test our hypothesis: (1) Assessment of the role of PKM2 in the pathogenesis of cardiac hypertrophy at the animal level: Transverse aortic constriction (TAC) is performed on PKM2 knockin (PKM2-KI) mice and PKM2 knockout (PKM2-KO) mice to assess the role of PKM2 overexpression and gene deletion in the pathogenesis of cardiac hypertrophy. (2) To evaluate the effect of direct intervention on PKM2 expression in the pathological process of cardiac hypertrophy: We will perform this research through overexpressing or silencing the PKM2 gene in neonatal rat cardiomyocytes with PKM2 adenovirus vectors. Elucidating the Molecular Mechanism of PKM2 involving Cardiac Hypertrophy: mTOR pathway and glycolysis pathway. For the purpose of our research, we will intervene in the pathogenesis of cardiac hypertrophy in primary cardiac myocytes by the PKM2 adenoviral vector, mTOR inhibitors. Elucidating the role and mechanism of PKM2 in the pathological process of cardiac hypertrophy, and further understanding the role of glucose metabolism and mTOR pathway in the pathogenesis of cardiac hypertrophy will provide a theoretical basis for the development of effective new drugs for cardiac hypertrophy.

糖酵解限速酶PKM2是mTOR信号通路下游的关键靶分子，在心肌肥厚的组织中表达升高，且参与调节心肌肥厚病理过程中关键基因表达。PKM2代偿性高表达，在心肌肥厚病理过程中发挥什么作用？对心肌肥厚的影响是否依赖mTOR通路？为探究这些问题，（1）在动物水平评估PKM2在心肌肥病理过程中作用：采用主动脉缩窄术构建心肌肥厚模型，分别用PKM2基因敲入小鼠（PKM2-KI），基因敲除小鼠（PKM2-KO）评估PKM2高表达和基因敲除状态在心肌肥厚病理过程中的作用。（2）通过PKM2腺病毒载体观察原代心肌细胞中PKM2不同表达水平时mTOR信号转导及糖酵解状况，以及使用mTOR抑制剂探讨分析mTOR信号转导对心肌肥厚的影响及其机制。进一步认识糖代谢和mTOR通路在PKM2调控心肌肥厚病理过程中的作用，为开发有效的心肌肥厚的新药提供理论依据。

背景：.丙酮酸激酶（PK）是催化糖酵解最后一步的关键限速酶，PK包括四种同工酶（PKL，PKR，PKM1，PKM2），其中PKM2主要存在于早期胚胎组织，在病理状态下例如肿瘤、心肌肥厚、心衰时，在肿瘤组织及心肌组织中也会高表达。PKM2有二聚体和四聚体有两种存在形式，二聚体有蛋白激酶活性，四聚体有能量代谢活性。我们课题组以构建动物心肌肥厚模型、引入PKM2-KI小鼠为载体，深入了解PKM2参与心肌肥厚的机制，并为防止心肌肥厚的治疗提供新靶点。.研究内容：.（1）应用主动脉缩窄术（TAC）建立野生小鼠及PKM2-KI小鼠心肌肥厚模型用于实验.（2）TAC术后2、4、6周检测心肌细胞PKM2表达并找到PKM2显著表达的时间点及心肌肥厚标记物（ANP、Myh7）、心肌纤维化标记物（col-1、MMP2）蛋白水平变化.（3）TAC术后应用小鼠高频超声、心脏称重、HE染色、天狼星红染色观察各组小鼠心脏结构变化.（4）TAC术后应用Western blot检测糖酵解关键蛋白LDHB及Akt/mTOR信号通路关键蛋白（Akt、mTOR）的表达变化.结果：.（1）PKM2基因过表达会加重病理性心肌肥厚.（2）PKM2可以两种身份参与心肌肥厚的调控：1）PKM2可以通过糖酵解途径调控心肌肥厚的发生发展；2）存在Akt/mTOR-PKM2信号通路调控心肌肥厚.（3）在TAC术后6周，心肌纤维化相关因子Col-1、MMP2的表达呈下降趋势。.关键数据：.（1）TAC术后，PKM2-KI小鼠与野生小鼠相比，室间隔厚度、左室后壁厚度增厚更明显，左心室内径缩短更明显。心肌收缩力增强更加显著。HE染色显示心肌细胞横截面积显著大。.（2）PKM2-KI TAC组与WT TAC相比，ANP、Myh7表达显著升高（n=3-5，p＜0.05）；LDBH表达显著上调（n=3-5，p＜0.05）；Akt/mTOR信号通路中mTOR、Akt表达显著下调（n=3-5，p＜0.05），P-mTOR有下调趋势（n=3-5，p＞0.05）。.（3）心肌纤维指标col-1、MMP2表达有下降趋势，天狼猩红染色显示心肌纤维化程度减轻。.科学意义：.本研究发现PKM2可以同过能量代谢和信号通路2种方式参与心肌肥厚的调控，同时具有增强心肌收缩力，对抗心肌纤维化的作用，为心肌病、心肌纤维化、心衰的诊治提供新的靶点。