油菜隐性细胞核雄性不育系9012AB不育基因Bnms3的功能分析

隐性细胞核雄性不育系9012AB是我国发现并已经广泛应用于油菜杂交种生产的一种重要的雄性不育类型。然而截止目前，该不育系育性调控的分子机理仍然不明。本课题组前期通过图位克隆方法已成功将其不育基因之一Bnms3定位在12kb区间内，包括1-3个候选基因。本研究将在此基础上，通过转基因互补实验鉴定出Bnms3的目标基因，进而利用表达分析和编码蛋白性质分析的方法验证Bnms3基因的功能。在此基础上，运用酵母双杂交系统分离与其互作的下游基因。采用单倍型分析方法，获得目标基因的功能标记，并确定该基因功能变异的关键结构域。最终，整合另外一个不育基因位点esp的研究结果，揭示9012AB中雄性败育的分子机理。该本项目的实施，一方面可以获得用于Bnms3位点的筛选和标记辅助育种的功能标记，另一方面则可以克隆到具有自主知识产权的重要功能基因Bnms3,以利于该重要性状的基因资源保护。

油菜隐性细胞核雄性不育系9012A的雄性育性受两个位点调控，分别是恢复基因位点BnMs3/Bnms3及复等位位点BnRf（包含3个复等位基因型BnRfa，BnRfb和BnRfc）。本研究在前期将BnMs3位点定位在C9染色体上一个约9.7 kb的物理区段内，包含3个候选基因。转基因互补实验证明，与拟南芥TIC40高度同源的ORF1能够完全恢复9012A的雄性不育，是BnMs3的目标基因。该基因命名为BnaC9.TIC40。序列分析发现，9012A中的BnaC9.TIC40是由于A10和C9染色体的非同源重组产生的，而临保系（TAM）中的Bnms3位点则是由于BnaC9.TIC40在编码区的一个2-bp的InDel而导致的蛋白提前终止所致。BnaC9.TIC40在油菜中组成性表达，其产物被定位于质体内。酵母双杂交发现BnaC9.TIC40和油菜中的TIC110-1成员之间存在互作，暗示着该基因的可能存在和拟南芥TIC40同样保守的功能。但是，在不育基因BnRfb缺失的前提下，BnaC9.TIC40的功能缺失突变仍然表现为雄性可育的表型，表明BnaC9.TIC40相比拟南芥TIC40进化出育性发育调控相关的功能。.为了进一步揭示9012A的雄性不育机理，利用图位克隆的方法成功的从一个约60 kb的大插入片段中，成功的分离到不育基因BnRfb。该基因是由三个拟南芥来源的基因融合而成的嵌合基因，其主要的部分是和拟南芥的mtHSP70-1高度同源，因而将其命名为BnA7.mtHSP70-1-like。序列分析发现，该基因同时存在于不育系和恢复系中（在启动子区存在两个InDel），而在临保系中完全缺失。拟南芥的遗传转化证明，来源于恢复系和不育系的BnRfb均能够导致拟南芥的完全雄性不育，其表型和油菜核不育系9012A的表型高度一致。因此，BnRfa应该对应于60 kb的插入片段内一个和BnRfb紧密连锁的基因。BnA7.mtHSP70-1-like在减数分裂到四分体时期的绒毡层和雄配子中表达量最高。与恢复基因BnMs3不同，BnA7.mtHSP70-1-like编码的长度为1386-aa的蛋白定位于细胞核。酵母双杂交显示，BnaC9.TIC40和BnA7.mtHSP70-1-like并不存在直接的互作。因此，上述两个基因介导着一条新的的调控雄性育性的路径。