线粒体途径凋亡对种子脱水伤害的响应机制

Recalcitrant seeds-production plants possess enormous business value and play a key role in the tropical and subtropical ecosystem. Because of drought and storage sensitivity, their germ long-term conservation is the important difficulty and one of the vital questions of seeds biology. In this study, desiccation-sensitive Clausena lansium (Chinese Wampee) and pre-imbibed soybean seeds whose desiccation tolerance was losing, are used as materials. Based on the systematic analysis of morphological alternations observed by TEM, DNA damage detected by TUNEL marker, mitchondrial actions determined by Clark oxygen electrode and apoptotic factors checked by immunodetection, the relationship between mitochondria related programmed cell death (PCD) events and seed desiccation injury will be investigated. In details, (1) morphological and physiological response; (2) influence on structure and function of mitochondria; (3) apoptotic induced factors, cytochrome C, release; (4) alteration of cytosolic Ca2+, (5) Caspase-liked protease's activation and impact factors and (6) hydrogen peroxide and nitrogen monoxide effection on mitochondria related PCD events of orthodox and recalcitrant seeds during desiccation will be explored. In view of these experiments, the pattern, possible pathways and impact factors of mitochondria PCD events on responding to desiccation injury will be elucidated, and PCD hypothesis of seed desiccation injury will be partly proved in the mitochondria pathway.

产顽拗性种子植物具有重要的经济价值和生态意义。顽拗性种子脱落时具较高的代谢活性，不耐脱水和贮藏是目前种子生物学研究的难点和重点，也是顽拗性种质资源长期保存必须解决的关键问题。本项目利用脱水敏感性的黄皮种子和吸胀后脱水耐性逐渐丧失的大豆种子作为研究体系，采用电子显微镜技术、TUNEL标记、Clark氧电极分析和免疫检测等方法，研究 脱水伤害过程中(1)不同种子的形态生理指标变化，(2) 线粒体结构与功能对脱水伤害响应的差异，(3) 线粒体途径凋亡因子细胞色素 c 的释放，(4) 线粒体结构功能损伤相关的细胞质Ca2+变化，(5) 类半胱氨酸蛋白酶的活性及其影响因子，以及 (6) H2O2和一氧化氮对种子脱水过程中线粒体途径凋亡事件的调节。基本探明线粒体途径凋亡对种子脱水伤害的响应方式，可能的途径，以及影响因子；从而从线粒体途径凋亡角度建立种子脱水伤害的PCD假说，为顽拗性种质资源的长期保存奠定坚实的理论基础。

项目研究依据脱水处理吸胀萌发过程中绿豆种子的含水量和生长指标实验结果建立了预吸胀0h，3h，6h，18h，24h；脱水25h的实验验证模型。对活性氧代谢与抗氧化系统的研究结果表明绿豆胚轴脱水敏感性直接体现为脱水后迅速提升的活性氧代谢水平和抗氧化能力的丧失。在活性氧代谢方面，H2O2应当被认为是绿豆胚轴的脱水耐性丧失的主要诱导因子。非酶抗氧化物质的检测结果显示，在预吸胀后期脱水明显导致抗氧化物质受到了明显损失，但未达到直接攻击的高水平，因此推断脱水产生的活性氧所致脱水敏感性应该与其诱导的PCD有关。.项目对脱水伤害过程中PCD事件的研究表明脱水胁迫诱导的氧代谢失衡是最终落实到胚轴分生组织发生细胞死亡从而降低种子生活力的。在亚细胞形态中，绿豆胚轴分生组织体现出核形态皱缩、核内核质靠边，线粒体破裂等PCD典型表征。同时，DNA完整性和Caspase与总核酸酶活性的变化结果则证明了PCD是胚轴发生分生组织细胞死亡，继而导致种子生活力下降的主要原因。.项目对PCD信号途径进行了多层次的探究。(1) 结合线粒体形态变化，线粒体膜电位原位染色与流式细胞定量实验和细胞色素C等实验证明了线粒体凋亡途径是脱水诱导PCD的主要形式。(2) 细胞质Ca2+浓度测定实验表明Ca2+信号在诱导PCD过程中应当发挥了作用，按照发生的时序其上游信号应直接是脱水诱导的水势变化。(3) 凋亡相关基因差异表达研究锁定了metacaspase和细胞色素C等，结果表明从预吸胀早期到中后期，metacaspase基因和核酸内切酶基因明显增加了类型和表达丰度；细胞色素C相关基因则从正常线粒体电子传递转向了细胞色素C的合成和转运。根据PCD各主要事件发生的时序，可以认为脱水诱导PCD的主要机制是线粒体凋亡途径的，其过程主要为：脱水诱导，Ca2+和线粒体呼吸电子传递变化，ROS和Ca2+诱导线粒体膜电位翻转，细胞色素C释放诱导PCD下游信号传递并最终执行。由脱水伤害机制的探讨，可以明确脱水敏感性的实质是脱水耐性玻璃化状态在水化弛豫后脱水诱导PCD所致胚轴分生组织细胞的不可逆损失。