葡萄抗根瘤蚜侵染转录因子基因WRKY表达与功能研究

Grape phylloxera (Daktulosphaira vitifolia Fitch) is an obligate parasites insect, distributed in the southern and northern part of China since 2005 till now. Once spread, it will destroy our self-root viticulture industry. Transcription factor gene WRKY is an important defence protein. Based on the DNA microarray analysis of rotstock 140Ru during phylloxera infestation, two obviously up-regulated WRKY genes are used as research target, the full length cDNA is cloned by RACE (rapid amplification of cDNA ends); the expression characteristics are analyzed by tissue localization, subcellular localization, qRT-PCR and Western blot; Different phylloxera-resistace grape varieties are inoculated with phylloxera to study the correlation of changes in WRKY expression and phylloxera resistance; Virus induce gene silence of WRKY in phylloxera-resistance varieties are inoculated with phlloxera to study the WRKY function on phylloxera resistace, include phylloxera growth and development, nodosities numbers and size, defence pathway enzymes actuvuty and key enzyme genes expression, secondary metabolites and feeding site tissue structure responses; Finally, we analyze the other WRKY gene expression of the virus induce one WRKY silence plant to study the functions between the two WRKY genes. We aim to understand the function of WRKY in grape phylloxera defence, which will lay a good foundation for phylloxera resistance improvement, and ensure grape industry sustainable development.

葡萄根瘤蚜为专性寄生害虫，05年至今在我国南北已均有分布，一旦传播扩散将导致我国自根栽培葡萄产业的毁灭。WRKY转录因子是一类重要的参与植物防御反应的蛋白。在前期基因芯片研究基础上，我们以砧木140Ru受侵染后表达显著上调的2个WRKY转录因子为目标，利用RACE技术获得cDNA全序列；通过组织定位、亚细胞定位及qRT-PCR和Western杂交研究其组织细胞表达特性；对不同抗性葡萄资源接种根瘤蚜，研究WRKY在转录和翻译水平上的表达变化与抗根瘤蚜能力的相关性；对病毒诱导瞬时转化抗性葡萄根系接种根瘤蚜，研究对抗根瘤蚜能力的影响：包括根瘤蚜生长发育、根结数量、防御途径相关酶活性及关键酶基因表达量、次生代谢和侵染位点组织结构响应；最后通过检测基因沉默植株中另一个WRKY基因的表达响应，分析两个成员间的功能关系。为了解WRKY在防御根瘤蚜侵染中的功能和抗性改良奠定基础，支持葡萄产业可持续发展。

葡萄根瘤蚜专性寄生葡萄，是世界范围内的检疫性害虫。生产上主要通过使用抗性砧木嫁接防治根瘤蚜，但我们对葡萄砧木抗耐根瘤蚜侵害的分子机理还知之甚少。植物WRKY转录因子在植物抵御生物胁迫方面发挥重要的调节作用。本项目以不同敏感型葡萄为试材，从全基因组的角度检测了葡萄所有WRKY基因响应根瘤蚜侵害的应答模式，并深入研究了葡萄根瘤蚜侵害引起的由WRKY转录因子介导的葡萄抗虫调控网络。主要结果如下。.本项目完成了对葡萄WRKY转录因子家族的鉴定和生物信息学分析。发现不同根瘤蚜抗性葡萄根和叶中WRKY基因的组成型表达量与其抗性无相关性，根瘤蚜侵害激活葡萄WRKY基因介导的诱导型防御反应。筛选得到几个在不同抗性品种（克瑞森和1103P）中对根瘤蚜侵害表现出不同表达模式的葡萄WRKY基因，如VvWRKY2-2、VvWRKY42、VvWRKY40-1（W40-1）、VvWRKY46（W46）和VvWRKY53，这些候选基因可能是调控葡萄与根瘤蚜互作关系的关键调节因子，具有潜在的研究价值。葡萄WRKY基因W40-1和W46编码的蛋白都定位于细胞核，能够与顺式作用元件Wbox (T)(T)TGAC(C/T)结合互作，具有转录激活活性。两个WRKY转录因子蛋白分别与PR基因VvCHI1B的启动子互作，说明根瘤蚜侵害过程中WRKY蛋白能在转录水平直接调节SA信号途径下游PRs基因的表达，而这种途径是不依赖于SA信号物质的积累和NPR1的参与。.本项目一方面揭示了WRKY调控葡萄-根瘤蚜互作关系的分子机理，明确了WRKY蛋白能在转录水平直接调节SA信号途径下游PRs基因的表达，为后续调控路径研究提供新的切入点和研究对象；另一方面筛选得到了调控葡萄抗根瘤蚜的关键WRKY候选基因，为将来应用研究提供理论支持。