调控生长锥骨架蛋白myosin II能够促进周围神经及脊髓神经的轴突再生

Mature CNS neurons cannot regenerate their axons after injury largely due to the inhibitory environment and diminishing intrinsic axon growth capacity. Because in vivo injured axons often encounter multiple inhibitory molecules simultaneously, recent studies have indicated that targeting individual inhibitors or their signaling pathways may not be sufficient to promote axon regeneration in vivo. The growth cone cytoskeleton is the final target of most. Recently, we showed that inhibition of growth cone cytoskeleton protein myosin II with pharmacological inhibitor drastically increases axon growth of multiple neuronal types over either extracted CNS myelin or CSPGs, two major categories of inhibitory molecules in the CNS. Based on our published studies and preliminary data, here we will determine 1) if genetically knocking down myosin II in adult sensory neurons is able to promote peripheral nerve or spinal cord axon regeneration following the traumatic injury, and 2) if inhibition of MLCK with either pharmacological inhibitor or shRNAs in adult sensory neurons will have promoting effect on axon regeneration. Together, our proposed study will provide evidence for a novel approach to promote axon regeneration after spinal cord injuries by targeting the nerve growth cone cytoskeleton protein.

脊髓损伤之后，因为成年CNS神经元自身的轴突再生能力有限以及抑制性微环境，中断的CNS神经轴突无法自行再生和修复，这使得损伤平面以下的功能永久丧失。由于很难同时敲除中枢神经系统中存在的所有抑制蛋白，迄今为止，针对脊髓抑制分子的研究均没有得到满意的效果。另外，生长锥是几乎所有抑制分子作用的最终靶器官。我们以前的药物学实验结果证明了只要抑制神经生长锥骨架蛋白myosin IIA/B，就能够促进体外培养的神经元轴突在抑制性分子Myelin和CSPGs上的生长。相关详细的遗传学证据及活体内研究依然欠缺，其作用机制也不详尽。故，本项目拟利用遗传学手段，在小鼠周围神经损伤及脊髓损伤模型上，检测敲除myosin II是否能够有效地促进活体内的神经轴突再生，并探索抑制myosin II能够促进神经轴突再生的生物学机制。同时,检测myosin II上游分子MLCK对神经轴突再生的影响。

各种突发事故、自然灾害甚至战争所造成的外周神经损伤的修复，特别是由于损伤导致的神经缺损的修复，到目前为止依然是一个世界性的难题。调控生长锥骨架蛋白组装是最近比较热门的促进轴突再生的研究方向之一。这里我们利用条件性肌球蛋白myosin IIA/B 的转基因小鼠，明确了抑制神经元的生长锥肌球蛋白(myosin IIA/B)能够显著促进受损视神经的轴突再生；并且发现，敲除成年感觉神经元中的myosin II A/B对已知的轴突再生信号通路没有显著影响。通常，肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）磷酸化myosin IIA/B之后会抑制其活性。一方面，我们发现神经受损之后，胞体中的MLCK mRNA和蛋白表达量都明显上升；如用药物抑制或者siRNA敲减MLCK，则明显抑制了小鼠成年感觉神经元和大脑皮层神经元的轴突生长。另一方面，肌球蛋白轻链磷酸酶 (myosin light chain phosphatase, MLCP)去磷酸化myosin II A/B会激活其活性。因此，我们检测了MLCP对哺乳动物神经轴突再生的调控作用。首先，我们发现小鼠坐骨神经受损之后，背根感觉神经元中肌球蛋白轻链磷酸酶的表达量明显下降，这意味着神经损伤导致肌球蛋白被激活。其次，通过药物局部抑制MLCP之后，可发现能够显著促进受损视神经和皮质脊髓束的轴突再生。此外，我们还发现，抑制MLCP主要影响神经生长锥的形态和骨架蛋白F-actin的分布。因此，调控myosin II A/B等神经元生长锥骨架蛋白的方法很有可能成为有效促进断裂轴突再生，从而治疗脊髓等中枢神经系统损伤的新的方法和手段。