褪黑素通过BMPs和Ihh-PTHrP信号通路加速软骨内成骨的作用机制研究

There are two types of ossification in the human body: endochondral and intramembranous ossification. Applicants have demonstrated that melatonin enhanced intramembranous ossification by stimulating osteogenic differentiation of MSCs (Zhang L et al, J Pineal Res 2010; Zhang L et al, J Pineal Res 2012). However, further study remains to be done on whether melatonin affects endochondral ossification. We preliminary study found that melatonin promoted MSCs chondrogenesis, which might be related to BMPs and Ihh signaling pathway, suggesting that melatonin may play an important role in endochondral bone formation. In this study, we will (i) study the role of melatonin on chondrogenic differentiate and hypertrophic differentiation of chondrocytes, and then investigate whether its role mediated by membrane receptors or nuclear receptors; (ii) reveal the molecular mechanism of melatonin by studying how melatonin enhances endochondral ossification through BMPs signaling pathway and Ihh-PTHrP negative feedback loop; (iii) finally apply melatonin to endochondral bone formation in vivo to investigate whether melatonin stimulate endochondral bone formation in mice. The result of this project should reveal the effect of melatonin on endochondral bone formation and provide further insight into role of melatonin on the process of bone formation.

膜内成骨和软骨内成骨是骨发生的两种方式。申请者研究发现褪黑素促进骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化而促进膜内成骨（Zhang L et al, J Pineal Res. 2010; Zhang L et al, J Pineal Res. 2012），但是褪黑素在软骨内成骨中的作用仍有待研究。申请者初步研究发现褪黑素促进MSCs软骨分化-肥大，其作用与BMPs和Ihh信号通路有关，这提示褪黑素可能加速软骨内成骨过程。本研究拟深入研究褪黑素在MSCs向软骨分化、肥大中的作用，并探讨其作用是否通过膜受体和核受体介导；研究褪黑素与BMPs信号通路和Ihh-PTHrP负反馈循环的关系，探讨褪黑素促进软骨细胞肥大分化的分子机制；最后在小鼠体内考察褪黑素与软骨内成骨的关系。从而阐明褪黑素在MSCs向软骨分化、肥大及软骨内成骨过程中的作用机制，揭示褪黑素在软骨内成骨中的重要意义。

膜内成骨和软骨内成骨是骨发生的两种方式。项目负责人课题组研究发现褪黑素促进骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化而促进膜内成骨（J Pineal Res. 2010; J Pineal Res. 2013），但是褪黑素在软骨内成骨中的作用仍有待研究。本项目在此基础上展开研究，主要研究结果如下：第一，褪黑素膜受体和核受体在MSCs以及软骨分化过程都高表达，其中核受体四种转录异构体中，只有RORα1 和RORα4表达，又以RORα4为主；第二，褪黑素可以促进MSCs向软骨细胞分化，同时促进加速软骨细胞肥大成熟分化，从而促进软骨内成骨，表现为软骨细胞体积增大，软骨陷窝增多，肥大软骨标志基因增多，如COL-10/RUNX-2/ALP/MMP-13/ PTHrPR/IHH的表达升高，而抑制软骨肥大的PTHrP则明显下调。第三，褪黑素促进软骨细胞肥大成熟分化的作用是通过膜受体和核受体介导的，同时也与改变IHH-PTHrP负反馈循环，和上调BMP2有关。第四，表达芯片结果揭示褪黑素的作用与激活WNT通路有关，但如何激活WNT通路仍有待研究。第五，构建PLGA载褪黑素缓释系统，并将其应用到大鼠腰椎后外侧融合术，术后结果显示，褪黑素可以明显促进局部骨形成，促进骨修复。因此，本项目阐明了褪黑素在MSCs向软骨分化、肥大及软骨内成骨过程中的重要作用以及其作用机制，揭示了褪黑素作为一个骨形成促进剂，在软骨内成骨中的重要意义。