光镊技术研究rpoS RNA非编码区局域结构的稳定性

It is well known that the function of no-coding RNA is defined by its structure. However, up to date, it is difficult to understand RNA 3-D conformation of molecules longer than 1000 nt and different software often give inconsistent prediction..Recently, we found the conformation of rpoS RNA untranslated region is very diverse under AFM but contain stem loops with similar shape. Stretching experiment done by optical tweezers revealed the unzipping force of self-inhibition stem loop is significant bigger than normal RNA hairpin..Therefore, we hypothesize that the no-coding region of rpoS mRNA may be constituted by multiple stem loops with strong internal interaction. Stem loops may connect together diversely. In this proposal, we plan to measure unzipping force, length and free energy of different stem loops, study their dynamic with optical tweezers. Thus, we will able to investigate the stability of each potential unit among rpoS mRNA untranslated region, relate these characteristics with mechanism of rpoS gene regulation and test our hypothesis. .We believe this study will facilitate prediction of RNA conformation by providing a new quantitative method. This work will be very meaningful for people to understand the mechanism of RNA folding and their biological functions.

RNA的生物学功能与其结构密切相关。但是对于长度超过1000nt的RNA三维结构了解非常有限，而且不同结构预测软件给出的结果也不一致。长链RNA结构研究是结构生物学的难点。.我们通过原子力显微镜发现rpoS信使RNA非编码区的卷曲方式多样，但存在一些外形相似的小茎环；光镊实验也发现其自抑制茎环内部结合强度大于一般RNA发卡结构的结合强度。.由此我们提出rpoS信使RNA非编码区域可能由一些内部结合力较强的片段组成，各片段再以不同形态相连接。我们拟通过光镊拉伸RNA非编码区不同的片段或茎环结构，研究打开的动力学过程，测量打开所需要的外力、长度、自由能等物理参数，讨论各个片段的稳定性以及其与该RNA生物学功能之间的关系，验证假说。.研究结果将提供一种辅助长链RNA空间结构预测新的定量研究方法，用于帮助人们理解RNA形成三维结构的动态过程以及其结构与生物学功能之间的关系，具有重要的生物学意义。

RNA空间结构的多样性和变化是其行使生物学功能的基础，所以研究RNA非编码区域的空间结构及其基因调控功能成为结构生物学关注的热点。常规的实验方法只能得到大量分子的平均效果，而掩盖了RNA结构多态性的重要信息。特别是在生物大分子发生结构变化时，无法对RNA结构改变时的动态过程进行精细的研究。近代发展的单分子物理方法突破了传统技术手段难以获得单分子动态信息的局限。特别是利用光镊提供的pN力对单个RNA进行拉伸可以定量测量RNA分子结构打开过程中的自由能变化，对深入理解RNA结构以及其生物学功能有重要意义。. 利用光镊技术对rpoS 信使RNA 非编码区的three-way junction部分结构进行了拉伸实验研究，测量RNA在打开-复性过程中光镊做功并推算出局部自由能的变化。通过rpoS自抑制茎环three-way junction在外力作用下展开/再折叠的实验确认该RNA按照理论预测的二级结构进行折叠。研究发现Mg2+在不重组RNA二级结构的情况下显著改变了RNA junction的自由能（从18.9 kJ/mole到34.9 kJ/mole）。并且结合小角度X射线散射实验和AFM图像提出增加的自由能可能会改变rpoS RNA不同茎环间的夹角,从而改善Hfq蛋白引导的sRNA和rpoS RNA自抑制茎环相互作用，在调控基因表达方面发挥作用。. 在长链非编码RNA方面，我们用光镊和AFM技术对已有的G4序列RNA进行了研究，发现了G4 RNA折叠成四螺旋颗粒的证据。通过物理模型分析，发现这种RNA四螺旋结构会导致RNA分子以及RNA分子和FUS蛋白之间发生协同相互作用。这种协同相互作用对RNA和FUS蛋白产生液-液相变，实现其生理功能具有重要意义。. 发展了通过锁相方法在同一组数据上同时进行光镊的测量和标定的实验方法并将光镊应用于肺癌细胞膜丝松弛曲线的研究，表达小分子RNA miR-92Boe的小细胞肺癌细胞系SHP77膜丝断裂的比例从16%增加到25%。这一结果显示高表达小分子RNA有可能通过改变细胞膜的机械特性来影响癌细胞的侵袭性。