玉米核雄性发育基因Ms1/ZmLBD33调控花药细胞形成和花粉育性的分子机理研究

Maize genic male-sterile mutants have been widely studied for its biological significance on pollen development and commercial value in hybrid seed production. However, molecular cloning and characterization of male sterility gene in maize has been few so far. Our previous study showed that at the uninuclear microspore stage, the abnormal pollen wall development occurred in maize male sterility1 (ms1) mutant and the inner materials in tapetal layer and microspore of ms1 mutant degraded rapidly. Using map-based cloning approach, the Ms1 gene was isolated and predicted to encode a novel LBD protein (ZmLBD33). Additionally, the Ms1 gene expressed specifically in immature tassels and conserved in plants. Here, a combination strategy of cytology, molecular biology and biochemistry will be used for functional analysis on Ms1/ZmLBD33 in regulating pollen development in maize. This research work includes: i) Microscopic observation of ms1 mutant to determine when and where Ms1 regulates the anther and pollen development, ii) Functional complement, targeted mutagenesis, subcelluar localization and organ-specific expression analysis of Ms1 gene to investigate its function in maize male sterility, iii) Validating protein interactions by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and Yeast two hybrid, and iv) Investigating whether the targeted mutagenesis by CRISPR-Cas9 of specific genes encoding proteins interacting with Ms1/ZmLBD33 results in phenotypic variation/mutation, especially for male sterility. This study will provide new insight into the molecular mechanism of Ms1/ZmLBD33 protein in modulating anther and pollen development in maize.

玉米核雄性不育突变体是研究花粉发育的理想材料，同时在玉米杂种优势利用、杂交育种和制种中具有重要应用价值。然而，目前玉米雄性不育基因的克隆与功能研究还很有限。本项目前期发现，玉米不育突变体ms1在单核小孢子期小孢子壁加厚，花药绒毡层结构发育异常，花粉内含物迅速降解变空。图位克隆结果显示Ms1基因编码一个新的LBD转录因子（ZmLBD33），在特定发育时期的雄穗中特异表达。据此，本项目拟从细胞学、分子生物学和生物化学等层面，通过ms1不育株和可育株不同发育时期花粉的超微观察明确Ms1作用时期和位点；通过Ms1基因的功能互补、定点突变、亚细胞定位、组织特异表达等实验，系统研究Ms1/ZmLBD33在玉米花粉发育中的功能；通过酵母双杂交、荧光双分子互补、双突变体等途径筛选Ms1/ ZmLBD33互作蛋白，探讨其调控花粉发育的遗传网络，从而全面解析LBD蛋白调控玉米花药细胞形成和花粉育性的分子机制。

花粉发育是植物种子形成的关键环节，也是作物分子育种的重要研究对象。植物雄配子发育对非生物胁迫敏感，依赖于花药和花粉的保护结构，如花药角质层和花粉外壁，以确保受精和种子生产的成功。如何控制和分配花药角质层和花粉外壁发育所需的物质和能量一直是研究的热点。玉米雄性不育突变体是研究花粉发育的理想材料和杂种优势利用的重要资源。玉米雄性不育基因的克隆及其功能机制解析，可以促进植物雄性发育生物学的发展和雄性不育技术的进步，具有重要的科学意义和应用价值。. 本项目利用玉米中发现的第一个雄性不育突变体ms1，通过综合利用细胞学、遗传学、分子生物学、基因编辑、多组学和生理生化分析等策略，揭示了ZmMs1调控玉米花药和花粉发育的分子调控机制：1）ZmMs1基因在花粉外壁合成中发挥重要调控作用，功能缺失突变后导致花粉外壁变厚，过表达后导致花粉外壁变薄，分别导致无花粉型的隐性和显性雄性不育表型；2）ZmMs1编码一个花药绒毡层特异表达的LBD转录因子，主要在减数分裂后的单核小孢子期发挥作用；2）ZmMs1作为转录抑制因子，作用于ZmbHLH51-ZmMYB84-ZmMs7转录调控通路的下游，受上游的ZmMYB84和ZmMs7直接激活表达，并且通过反馈抑制环调节其上游的3个转录因子，直接或间接调控孢粉素和花药绒毡层PCD相关基因，进而精准调节玉米花药和花粉发育。这是在植物中首次发现ZmbHLH51-ZmMYB84-ZmMs7花药发育转录调控通路的下游抑制因子，并且在不同植物中的功能相对保守，对植物的雄性发育生物学和花粉发育的分子机制研究具有巨大的推动作用，具有重要的科学意义。. 同时，项目构建了玉米显性不育载体p5126-ZmMs1，并转化玉米获得了遗传稳定的显性不育转基因株系，为创制不同遗传背景的玉米显性不育系并用于杂交育种和杂交制种中，奠定了材料和技术基础。