月季花朵失水胁迫诱导基因表达谱分析与重要基因功能鉴定

月季切花（Rosa Hybrida）在全球花卉贸易中销售量和销售额均居切花之首。失水胁迫是月季切花流通运输损耗的主要原因，导致花朵不能正常开放。探明月季切花失水胁迫耐性机理，解析其失水胁迫响应基因网络，对研究切花采后保鲜技术具有理论和实践意义。.本研究拟通过SSH方法构建月季花朵失水胁迫抑制差减文库，高通量分离失水胁迫诱导表达基因。利用cDNA 芯片杂交技术对获得的差异基因进行表达谱分析。结合生物信息学方法，确定月季切花失水胁迫耐性相关的关键生化途径以及重要的候选基因。利用功能互补、基因沉默、转化模式植物等方法鉴定候选基因功能，从而确定与月季切花失水胁迫耐性相关的关键基因。本课题的实施可望获得月季花朵失水胁迫耐性相关的表达谱及其重要基因，为研究月季切花失水胁迫耐性的分子机理奠定基础，为通过遗传工程改良切花失水胁迫耐性提供基因资源。

失水胁迫影响花瓣扩张，从而导致花朵不能正常开放。影响花瓣扩张主要有3个方面：细胞壁代谢、细胞膨压变化和细胞骨架的重构。然而，至今为止失水胁迫影响花瓣扩张的分子机制还不清楚。. 为了解月季花瓣扩张过程中的失水胁迫耐性的转录调节机制。本项目首先通过构建月季花朵响应失水胁迫的差减文库（SSH），对SSH分析结果表明：获得3513个UniEST，然后利用基因芯片分析这些UniEST在重复失水胁迫处理下的基因表达谱，发现有54个基因与失水胁迫过程密切相关，这些基因的表达在一次失水过程中被上调，复水恢复至失水前甚至被下调，二次失水又被上调。.从这些与失水密切相关的基因中，我们选择了一个失水强烈诱导的NAC转录因子基因进一步分析。推测氨基酸序列比对结果表明该基因为NAC家族转录因子，并命名为RhNAC2。进化树分析发现该基因与拟南芥NAC家族中的植物发育分枝亲缘关系最近。利用GO enrichment分析月季花瓣中失水胁迫影响的生化途径，结果表明‘plant type cell wall organization’途径与失水胁迫密切相关，从该途径中选择了一个受失水急剧诱导的功能蛋白RhEXPA4进一步分析。. 利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）分别在月季花瓣中沉默RhNAC2和RhEXPA4，结果表明：沉默后月季花瓣中显著降低了花瓣鲜重和宽度的恢复速率及花瓣小圆片的恢复能力，异源过表达RhNAC2和RhEXPA4的拟南芥显著增强植株的耐旱性。同时进一步研究发现，RhNAC2沉默的月季花瓣中RhEXPA4表达量降低，而且利用电泳迁移率实验（EMSA）分析和拟南芥原生质体瞬时表达分析，发现RhNAC2的N端与RhEXPA4启动子能相互结合。利用拟南芥Affenix基因芯片分析RhNAC2过表达拟南芥植株发现，有20个细胞壁相关的基因被上调，其中包括7个expansin家族成员。这些结果表明RhEXPA4可能是RhNAC2的下游基因。. 综上所述，本研究推断RhNAC2和RhEXPA4共同参与调节月季花瓣扩展过程中的失水胁迫耐性，同时RhNAC2蛋白可能调节了RhEXPA4基因的表达。