油菜光敏核不育基因的精细定位及候选基因分析

光敏核不育HY50S是1999年从甘蓝型油菜品种汇油50当中发现的一种新型变异，不同于现有的温敏、光温敏核不育。其育性受2对隐性细胞核不育基因pms1、pms2基因控制，短光不育、长光可育，在两系杂交油菜育种当中具有巨大应用潜力。本项目以HY50S的不同近等基因系为试材，分别筛选与pms1、pms2紧密连锁的SRAP、AFLP分子标记，并转化为SCAR标记。然后以HY50S×中双11的F2群体构建遗传连锁图谱，进行pms1、pms2精细定位。在此基础上借助与拟南芥、白菜等的基因组共线性区段，选择候选基因，进行扩增、测序，检测近等基因系之间的序列差异，并分析育性转换过程中候选基因表达情况。所得结果将为基因命名、基因功能验证奠定基础。

Huiyou50S、SP2S是分别从品种汇油50、欧洲引进资源SP2当中发现的两种育性相反的代表性油菜光温敏核不育材料。Huiyou50S低温短光不育、高温长光可育，SP2S低温可育、高温不育，在两系杂交油菜育种当中具有不同应用方式。本项目分别以不同近等基因系为试材，通过人工气候箱处理、半薄切片观察、田间育性调查以及分子标记技术，研究了甘蓝型油菜温敏雄性不育材料的温度响应规律、细胞学败育特征、遗传模式及不育基因遗传定位。在此基础上借助油菜连锁图谱及A、C基因组序列筛选候选基因，并分析育性转换过程中候选基因表达情况。.研究结果为：（1）Huiyou50S属于反型温敏不育系，育性转换临界温度昼22℃/夜12℃；（2）Huiyou50S的花药败育发生在单核期，小孢子细胞内容物收缩、解体，最终只剩空壳，绒毡层细胞在单核后期提前降解消失；（3）Huiyou50S×中双11正反交F2、BC1的育性分离比符合一对隐性基因控制的遗传模式；（4）采用分离群体分组分析法（BSA）筛选到与不育基因连锁的SRAP标记2个，SSR分子标记3个，并将不育基因初步定位在A10连锁群上。（5）SP2S属温敏核不育，临界温度18℃/夜8℃，育性遗传分离比例符合2对隐性基因遗传模式。苯胺蓝染色荧光检测发现甘蓝型油菜雄性不育系SP2S四分体及小孢子被大量胼胝质包裹，而且降解困难，壁物质降解延迟使得小孢子粘连在一起。（6）对胼胝质酶基因BnMSR66进行扩增及测序，所得片段长度445bp，SP2F和SP2S材料的cDNA和DNA序列相同。包含一个全长390bp的开放阅读框，编码130个氨基酸。（7）对花蕾不同发育时期参与四分体外壁纤维素降解的基因BnQRT1，BnQRT2，BnQRT3及胼胝质降解相关基因BnA6和BnMSR66进行实时荧光PCR定量分析，这些基因在不育株中表达量比可育株中大幅度提高，胼胝质过多而且延迟降解趋势与荧光染色观察结果一致。表明绒毡层变形及功能异常导致小孢子释放有关酶基因表达异常与小孢子败育有关。（8）SP2S、SP2F进行高温、低温处理，提取高温不育SP2S（SR）、低温育SP2S（SL）、高温可育SP2F（FR）、低温可育SP2F（FL）四种样品的RNA，构建测序文库。进行solexa高通量测序。每样品获得约5G数据量。转录组分析发现一些重要的生物途径参与雄性败育发生过程。