离体保存罗汉果种质及对其遗传稳定性和田间生物学特性的影响

离体保存是植物种质尤其是营养繁殖植物的重要保存方式，在作物遗传改良和保持植物种质资源遗传多样性方面具有重要意义。罗汉果是我国特有的药食兼用植物，长期无性繁殖，种性退化且种植品种单一，一些种质资源正在流失。本项目在前期开展的青皮罗汉果玻璃化超低温保存基础上，对不同基因型罗汉果进行离体保存研究，探索适应于缓慢生长法保存和超低温保存的程序和方法，系统建立其离体保存技术体系。用AFLP和MSAP技术检测和分析基因组DNA结构和甲基化变化，评价离体保存的遗传稳定性，初步分析离体保存诱导的甲基化差异片段和蛋白，为进一步揭示超低温保存的机理提供依据。研究离体保存罗汉果的田间生物学特性，对保存材料的未来实用性进行评估，为罗汉果种质资源的保护和开发利用奠定基础，从而更好地为罗汉果产业的可持续发展服务。

以收集的不同基因型罗汉果种质培养的试管苗带节茎段开展高渗透压、生长抑制剂、培养基养分、封口方式及复合处理下的缓慢生长法离体保存，1/2MS和1/4MS，甘露醇/蔗糖浓度比为1：1～1：2，0.5～2 mg/L P P333，100～400 mg/L B9，50～400mg/L CCC ，2.0～4.0mg/L ABA，无孔聚乙烯膜封口，3mg/L PP333与1/2MS协同作用利于保存。适宜条件下各品种保存6个月的存活率都超过90%,最高达100%；恢复生长、增殖及形态正常,存活率为100%。通过正交实验筛选确定了关键影响因素，结合单因素实验建立起适合不同种质茎尖的包埋-玻璃化法超低温保存技术体系（存活率26.67%～100%）和小滴-玻璃化法超低温保存技术体系（存活率41%～76.30%，再生率14%～62.20 %）。缓慢生长法保存后材料的ISSR检测显示没有变异带产生；小滴-玻璃化法超低温保存的罗汉果茎尖AFLP分析表明有差异条带，平均差异位点率为4.94%；MSAP 分析显示DNA总甲基化比率降低，主要趋势是去甲基化；离体保存后田间种植材料的AFLP分析显示平均差异位点率4.02%，多态性较保存后低尤其是以超低温方式保存的；MSAP分析显示总甲基化比率较保存后增加，与对照相比仍主要表现为去甲基化；结果表明离体保存和田间种植过程中都可发生DNA的结构和甲基化状态的改变，变异的程度品种间有差异。离体保存后罗汉果的田间生长动态与保存方法和品种相关，开花结果期的光合特性变化与对照相似，相差幅度不大；总叶绿素含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量接近或高于对照。项目首次系统完成了罗汉果种质的离体保存研究，建立起离体保存的技术体系，并揭示了离体保存对种质的遗传稳定性和田间生物学特性的影响，对罗汉果及其他种质的离体保存有重要理论意义和实践价值。