黑尾叶蝉RNAi免疫途径调控水稻矮缩病毒持久增殖的机制研究

RNA interference (RNAi) is generally thought to be an evolutionarily conserved antiviral immunity pathway in insects. Rice dwarf virus (RDV) established the persistent-propagation in the green rice leafhopper vector Nephotettix cincticeps. However, the mechanism for the modulation of the persistent-propagation of RDV by the vector RNAi is unknown, thus blocking the taking of efficient measures to control transmission of virus by insect vector. With the pathogen systems, we characterize the viral-derived small interfering RNAs (vsiRNAs) in cultured cells derived from Nephotettix cincticeps infected with RDV by small RNA deep sequencing; screen the key RNAi immunity factors which modulate the viral persistent-propagation of RDV through the insect vector, its cultured cell lines and the RNAi induced by dsRNAs. We will also identify the sub-cell position of RNAi pathway and nucleotide length of vsiRNAs binding with different argonaute proteins by immunolabelling and co-immunoprecipitation. These results will reveal the molecular mechanism for the modulation of the persistent-propagation of RDV by the vector RNAi immunity and illustrate the mechanism for viral transmission by insect vector. Thereby, this study is important not only for exploring new efficient strategies to block the viral spread by insect vector, but also for providing theoretic base for administering disease caused by rice viruses.

RNA干扰（RNAi）是昆虫保守的抗病毒免疫途径。水稻矮缩病毒（RDV）在介体昆虫黑尾叶蝉体内建立持久增殖。但是介体黑尾叶蝉RNAi途径调控RDV持久增殖的机制仍不明确，限制了采取有效手段阻断该介体传播该病毒。本项目拟以“RDV–黑尾叶蝉”的病原系统为研究对象，通过深度测序分析RDV侵染的介体培养细胞内病毒源小分子RNA（vsiRNAs）的产生和分布特征；利用介体及其培养细胞和dsRNA诱导的RNAi技术体系，筛选调控RDV在介体及其培养细胞内持久增殖的RNAi免疫途径的关键因子；进一步通过免疫标记和免疫共沉淀等技术确定RNAi免疫途径的胞内亚细胞定位以及与不同Argonaute蛋白结合的vsiRNAs的大小；从而揭示黑尾叶蝉RNAi免疫途径调控RDV持久增殖的分子机制，解析RNAi免疫途径调控黑尾叶蝉传播RDV的机理，从而为探索有效的水稻病毒病害防控策略提供理论依据。

水稻矮缩病毒 (RDV) 由介体昆虫黑尾叶蝉以持久性增殖型方式传播。然而，黑尾叶蝉RNAi抗病毒途径调控RDV持久增值的机制未见报道。本项目首先通过small RNA深度测序鉴定分析了RDV侵染黑尾叶蝉及其培养细胞后病毒来源的小分子RNA（vsiRNAs）长度、极性、碱基偏好性和基因组频率等特征；同时在前期转录组的基础上通过RACE克隆了黑尾叶蝉RNAi免疫途径主要相关基因DCR和AGO，序列分析表明DCR和AGO均具有特征序列，RT-qPCR实验表明DCR和AGO基因在不同龄期和不同组织器官的表达具有时空表差异性以及对RDV侵染具有选择性的差异表达，上述结果明确了黑尾叶蝉体内存在RNAi免疫途径。随后，在黑尾叶蝉体内及其培养细胞水平通过dsRNAs显微注射和转染法干扰RNAi免疫途径中siRNA关键基因DCR2和AGO2的表达后黑尾叶蝉的获毒率和传毒率均、RDV的复制增值水平均显著提高，而干扰miRNA关键基因DCR1和AGO1基因的表达未获得相似结果，因此该结果明确了黑尾叶蝉RNAi免疫中的siRNA途径具有调控RDV侵染的抗病毒免疫作用。接着成功制备了浓度高和效价高AGO2多克隆抗体，该结果为研究黑尾叶蝉RNAi免疫途径的亚细胞定位以及AGO蛋白结合的病毒vsiRNAs大小做好了材料准备。最后，鉴定分析了黑尾叶蝉肌钙蛋白TnC的序列特征和表达特性；通过显微注射等方法干扰TnC的表达后，昆虫的存活率、摄食能力、繁殖能力和体重等生活力，RDV侵染黑尾叶蝉后，小管蛋白Pns10与TnC互作降低了TnC的表达水平，进而影响昆虫存活率、摄食能力和繁殖能力等生活力，因此，该结果暗示肌钙蛋白TnC可能是一个新型的防控黑尾叶蝉的靶点。总之，上述结果揭示了RNAi免疫途径调控RDV侵染的分子机制，为探索有效的水稻病毒病害防控策略提供理论依据。