LOG5b启动子的自然变异影响苹果砧木耐盐性的分子遗传机制研究

Both ethylene and cytokinin could regulate the salt tolerance of apple rootstocks. Using robusta × M.9 hybrid population, we found a cytokinin synthetase gene LOG5b in the QTL interval of salt tolerance. The number of tandem repeats of the DRE element (a binding site of the ERF) on LOG5b promoter differs between the two parents. This project intends to take ERF4 combining with LOG5b promoter as the breakthrough point. We will find out whether ERF4 directly acts on the DRE element of LOG5b promoter to affect the salt tolerance of apple rootstocks, using EMSA, ChIP-qPCR and VIGS assay. The detection of GFP/GUS dual-label transient expression and LUC/REN dual-luciferase activity will be used to confirm whether the variable number of tandem repeats of DRE element affect the transcriptional efficiency of LOG5b in apple rootstock. We will finally clarify the effects of LOG5b and its promoter variation on the salt tolerance of apple rootstocks by obtaining a series of different genotype promoter-driven LOG5b transgenic apple callus. These will provide resistance genetic resources and theoretical basis for molecular-assisted breeding of apple rootstocks.

乙烯和细胞分裂素对苹果砧木耐盐性均具有重要调控作用。利用八棱海棠×M.9杂交群体，在后代耐盐性的QTL区间上发现了一个细胞分裂素合成酶基因LOG5b。其启动子上DRE元件（ERF结合元件之一）的串联重复数目在两亲本间存在差异。本项目拟以乙烯响应因子ERF4在酵母单杂交系统中能够结合LOG5b启动子为突破口，利用EMSA、ChIP-qPCR和VIGS等技术手段，明确ERF4如何作用于LOG5b启动子DRE元件来影响苹果砧木耐盐性。利用GFP/GUS双标签瞬时表达、LUC/REN双荧光素酶活性等检测手段，确认DRE元件串联重复变异如何影响LOG5b的转录效率。通过获得不同基因型启动子驱动的LOG5b转基因苹果愈伤，明晰LOG5b及其启动子变异对苹果砧木耐盐性的影响，为苹果砧木的分子辅助育种提供抗性基因储备和理论依据。

苹果是我国北方地区栽培规模最大的果树树种，选育耐盐性苹果砧木可以使盐渍化立地条件下的苹果生产获得更优的产量和品质。研究内容主要分为三部分：第一部分“LOG5b影响苹果砧木耐盐性的调控路径研究”，通过酵母单杂交试验、电泳迁移率试验和ChIP-qPCR试验确认了ERF4与LOG5b启动子间的互作关系，明确了LOG5b在耐盐性调控网络中的位置；第二部分“DRE元件串联重复变异对LOG5b转录效率的影响研究”，通过GUS/GFP双标签瞬时表达检测技术和LUC/REN双荧光素酶活性检测技术确认了5DRE基因型的LOG5b启动子活性显著高于7DRE基因型的LOG5b启动子活性，揭示了DRE元件串联重复变异在转录水平调控LOG5b来影响苹果砧木细胞分裂素合成；第三部分“DRE元件串联重复变异对苹果砧木耐盐性的影响研究”，通过构建一系列LOG5b的表达或干扰载体，转化苹果愈伤和苹果植株，以及利用八棱海棠×M.9杂交后代进行耐盐性评价，通过检测鲜重、盐害指数、丙二醛、活性氧、抗氧化酶、抗坏血酸-谷胱甘肽循环组分、光合气体交换和叶绿素荧光参数等生理生化指标，确认了5DRE基因型的转基因愈伤或株系的耐盐性强于7DRE基因型的转基因愈伤或株系，明晰了DRE元件串联重复变异的生物学意义。本项目鉴定了LOG5b为苹果砧木耐盐性的关键标记基因，揭示了LOG5b启动子的5DRE基因型通过维持细胞分裂素稳态和氧化还原平衡提高植株耐盐性的内在规律，开发了基于5DRE基因型的苹果砧木耐盐性预选分子标记。