非人灵长类逆向示踪AAV病毒的改造及在神经环路解析中的应用

Non-human primates (NHP) are important model organisms for neuroscience research, they play an important role in the research that aims at understanding the principles of intelligence and mechanisms of brain disorders. However, technologies that can be used for NHP neuroscience research, especially neural circuit tracing techniques are still very limited. Adeno-associated virus (AAV) has been used in NHP brain structural and functional research given its low immunogenicity, high titer, and strong neurotropism, but there is currently no AAV variant that can retrogradely label NHP neurons with high efficiency. The proposed project will focus on modifying and developing novel AAV tracers that can be used for retrograde labeling of NHP neurons. We propose to: (1) Carry out point mutations and directional evolution screenings on AAV serotypes 1/5/6/7/8/9/DJ, and test and find AAV variants that can be used for retrograde labeling in the mice; (2) Test labeling efficacy of novel AAV variants in macaque monkeys; (3) Use these AAV tracers to label neocortex neuronal subtypes that project to distinct brain areas and analyze their molecular and functional properties.

非人灵长类动物是神经科学研究的重要模式动物，对于理解智能的内在规律以及解析脑疾病的发病机制起着重要的作用。但是，适用于该类动物的研究工具体系，特别是神经环路示踪工具还非常缺乏。腺相关病毒（AAV）由于其免疫原性低、滴度高以及神经细胞感染能力强等优点，已被应用于非人灵长类动物脑结构和功能研究中，但尚无可以用于在猴脑中高效逆向标记神经环路的AAV。本项目将聚焦于使用分子遗传学方法改造和发展适用于非人灵长类神经元逆向示踪的新型AAV病毒工具，具体研究内容包括：（1）对AAV1/5/6/7/8/9/DJ七种血清型开展定点突变和定向进化筛选，在小鼠中初步检测并找到有效逆向标记的AAV突变株；（2）在猕猴中验证所获得AAV突变株的逆向标记效率；（3）使用获得的AAV突变株标记猕猴新皮层投射到不同脑区的神经元亚型并对其分子和功能特性进行研究。

非人灵长类动物是神经科学研究的重要模式动物，对于理解智能的内在规律以及解析脑疾病的发病机制和开发诊疗策略起着重要的作用。但是，适用于该类动物的研究工具体系，特别是神经环路示踪工具还非常缺乏。腺相关病毒（AAV）由于其低毒性、低免疫原性以及神经细胞感染能力强等优点，已被应用于非人灵长类动物脑结构和功能研究中，但尚缺乏可以用于在猴脑中高效逆向标记神经环路的AAV。针对这一技术瓶颈，本项目开展了AAV衣壳进化、病毒逆向示踪效率测试、神经环路功能调控以及脑疾病动物模型症状干预等相关研究工作，并取得了以下研究进展。（1）开发了能够在小鼠和猕猴脑中高效逆向标记皮层投射神经元的逆向示踪病毒AAV-DJ8R，并成功使用该病毒对小鼠和猕猴皮层的投射神经元进行了功能调控；（2）开发了能够在小鼠和猕猴脑中高效逆向标记纹状体-黑质神经环路的逆向示踪病毒AAVnR12，同时开发了能够驱动目标基因在纹状体D1中棘神经元（D1-MSN）高效表达的启动子GxP，并使用GxP+AAVnR12工具体系实现了对纹状体D1-MSN的特异性功能调控；（3）使用GPX+AAVnR12并结合化学遗传学，实现了在小鼠和猕猴帕金森症动物模型中逆转其运动相关症状。以上研究成果为非人灵长类模式动物的神经环路解析和功能调控提供了新的AAV病毒示踪工具，发展的相关技术在脑疾病的干预上也具有一定的临床应用前景。