软骨特异lncRNA—RP11-58O15.1-Wnt5a轴在骨关节炎中的作用及机制研究

Long noncoding RNAs (lncRNAs) are involved in diverse biological processes, but their role in osteoarthritis (OA) remains unknown. We previously identified the differentially expressed lncRNAs in OA cartilage by microarray and preliminary data showed that manipulation of gene expression of RP11-58O15.1, a novel lncRNA, affected expression of Wnt5a. Moreover, Wnt5a has been reported to participate in regulating biological function of chondrocytes, osteoblasts and osteoclasts. These results indicated that RP11-58O15.1 may be involved in cartilage degeneration and subchondral bone remodeling in OA via regulation of Wnt5a. In this project, we plan to determine the role of RP11-58O15.1 in chondrocytes and the mechanism on regulation of Wnt5a by knockdown and overexpression of RP11-58O15.1. Then we will further establish a co-culture model to investigate the effects of chondrocyte-expressed RP11-58O15.1 on osteoblasts and osteoclasts and explore the involvement of Wnt5a through rescue experiments. Lastly, we will utilize a DMM mouse model to clarify the role of RP11-58O15.1-Wnt5a axis in OA in vivo. These studies will provide new information for function of lncRNAs and pathogenesis of OA and provide novel potential targets in prevention and treatment of OA.

长链非编码RNA（lncRNA）具有重要的生物学功能，但其在骨关节炎（OA）中的作用与机制尚未阐明。我们前期通过基因芯片筛选出在OA软骨中表达变化的lncRNA，并通过预实验发现其中新的lncRNA分子RP11-58O15.1影响Wnt5a（可调节软骨、成骨与破骨细胞功能）的表达，提示RP11-58O15.1可能通过调控Wnt5a介导OA中软骨和软骨下骨的病理改变。本课题拟通过敲低和过表达软骨细胞RP11-58O15.1，探索RP11-58O15.1在软骨细胞中的功能及其对Wnt5a的调控机制；并通过体外细胞共培养模型，探讨软骨细胞中RP11-58O15.1对成骨细胞/破骨细胞功能的影响，通过拯救实验验证Wnt5a在其中的作用；最后应用小鼠DMM模型验证RP11-58O15.1-Wnt5a轴在OA发生中的作用，为lncRNA的功能以及OA的发病机制提供新内容，为防治OA提供新的潜在靶点。

骨关节炎（OA）的发病机制尚未完全阐明。既往研究提示非编码RNA以及软骨与软骨下骨的相互作用参与调控OA的发生发展，但具体的调控机制仍不清楚。我们发现在退变关节软骨中特异性的lncRNA-AK123567表达明显上调，OA软骨细胞内的Wnt5a表达和分泌的外泌体中Wnt5a也明显上调，而在软骨细胞中敲低AK123567能够促进软骨合成代谢基因COL2的表达而抑制分解代谢基因MMP13的表达，并且能抑制Wnt5a的表达，提示AK123567可能通过调控Wnt5a影响软骨细胞的退变。为了进一步研究外泌体lncRNA对软骨分化和退变的作用，我们利用基因测序检测了人脂肪干细胞成软骨分化过程中分泌的外泌体中的lncRNA表达谱，鉴定了在成软骨分化中表达差异的外泌体lncRNA，并进一步通过生物信息学分析对差异表达的lncRNA和mRNA进行共表达网络分析、GO分析以及KEGG通路分析，提示这些差异表达lncRNA可能参与调控软骨细胞退变。基于我们前期的研究结果，OA中软骨与软骨下骨的相互作用可能通过外泌体途径进行调控，因此通过构建小鼠OA模型，通过TRAP染色发现随着OA的发展，软骨下骨中破骨细胞逐渐增多；进一步我们通过基因芯片检测了骨髓中破骨细胞中的miRNA表达谱，发现了一系列表达上调的miRNA（miR-21a-5p、miR-214-3p、miR-30a-5p、miR-30d-5p），并通过qPCR证实了这些miRNA不仅在OA小鼠的软骨下骨中破骨细胞的外泌体中表达上调，而且在骨髓中破骨细胞的外泌体、血清中的外泌体中也是表达上调的；并进一步收集了膝关节扭伤患者和正常人的血清分离外泌体，发现这些miRNA在膝关节扭伤患者的血清外泌体中也是表达上调的，进一步体内研究发现抑制破骨细胞中外泌体miRNA的表达或者阻断破骨细胞释放这些外泌体miRNA能够延缓小鼠的骨关节炎进展，进一步机制研究发现破骨细胞分泌的外泌体miRNA通过与软骨细胞相互作用而促进软骨细胞外基质的降解、软骨下骨的血管化和神经化，并且注射靶向破骨细胞外泌体的抑制剂能够延缓小鼠的骨关节炎进展，这些结果揭示了非编码RNA调控软骨和软骨下骨相互作用在OA发生发展中的分子机制。