大气压低温等离子体对酿酒酵母细胞氧化损伤效应及其机理的研究

Recently, the bactericidal effect of nonthermal plasma in medical devices, skin, food, materials, stomatology, and environment as well as nonthermal plasma induced apoptosis in cancer cells have been the hot research topics of plasma medicine. Reactive oxygen species (ROS) in nonthermal plasma is considered to play important roles in sterilization and inhibition of tumor growth. In order to further clarify the mechanism of ROS in nonthermal plasma induced oxidative damage on organisms, this project intends to use the model organism (Saccharomyces cerevisiae) as the experimental object, carry out the following research: 1) determination the major ROS in the nonthermal plasma by using optical emission spectroscopy (OES) and electron spin resonance (ESR); 2) the damage effects of nonthermal plasma at different doses on yeast cells; 3) the effect of nonthermal plasma on intracellular redox balance, calcium balance, pH balance, energy metabolism and mitochondria in yeast cells; 4) identification of the key ROS components leading to the nonthermal plasma induced cell injury by comparing the damage effects of cold plasma on yeast cells after being respectively added four specific scavengers to eliminate hydroxyl, singlet oxygen, superoxide anion radical, nitric oxide radical in nonthermal plasma. This project will improve the damage mechanism of atmospheric pressure cold plasma on cells, and provide scientific basis for the application of nonthermal plasma on sterilization and cancer therapy.

近年来，大气压低温等离子体在医疗器械、皮肤、食品、材料、口腔、环境领域的杀菌效应以及促肿瘤细胞凋亡效应一直是等离子体医学的研究热点。低温等离子体中的活性氧(ROS)成分被认为在杀菌和抑制肿瘤生长中起着关键作用。为进一步阐明低温等离子体中ROS对生物体的氧化损伤机制，本项目拟用模式生物酿酒酵母细胞为实验对象，开展以下研究：①利用发射光谱及电子自旋共振技术测定低温等离子体中的主要活性氧成分；②不同剂量的低温等离子体处理酵母细胞的损伤效应；③低温等离子体对酵母胞内氧化还原平衡、钙离子平衡、酸碱平衡、能量代谢、线粒体的影响; ④比较低温等离子体对酵母细胞中分别加入羟基、单线态氧、超氧阴离子自由基、一氧化氮自由基的特异性清除剂后的损伤效应，从而鉴定出等离子体导致细胞损伤的关键ROS成分。本项目完善了大气压低温等离子体对细胞的损伤作用机制，并为低温等离子体应用于杀菌和抑制肿瘤细胞领域提供科学理论依据。

沿面放电因其能够产生大面积、宏观均匀的等离子体，在生物医学领域具有很好的应用前景，但是沿面放电等离子体主要活性成分及其杀菌机理仍不清楚。因此，本项目研究了沿面放电等离子体在气相、组织相、液相中产生的主要活性氧氮（RONS）成分，并以真核模式生物酿酒酵母为实验对象从细胞、亚细胞水平系统地研究等离子体杀菌机制，以及不同RONS的杀菌贡献与特异性攻击靶标。本项目主要研究成果如下：(1)通过采用琼脂糖凝胶组织模型对比研究了氦气和空气沿面放电等离子体在组织相产生的主要RONS、二维分布及其对酵母的杀菌效果。研究结果表明氦气等离子体主要产生羟基（∙OH）、过氧化氢（H2O2），它们分布在每个微放电单元的中间部位。而空气等离子体主要产生臭氧（O3）、亚硝酸盐、过氧亚硝酸盐，它们均匀地分布在整个组织相表面。氦气和空气沿面放电等离子体的主要杀菌成分分别是∙OH与O3。（2）通过皮尔森相关系数研究∙OH、H2O2、氧化还原电势、pH在沿面放电等离子体杀灭酵母细胞中的作用。研究结果表明在上述四种因素中，∙OH是最重要的杀菌成分，它可以攻击酵母细胞膜，造成胞内活性氧与氢离子的累积，最终导致细胞死亡。（3）通过采用特异性化学探针与相应的清除剂研究了沿面放电等离子体在溶液中产生的主要RONS及其对酵母的杀灭机理。研究结果表明等离子体能够破坏酵母的细胞膜系统、胞内氧化还原平衡、酸碱平衡、钙离子与钾离子平衡、能量代谢系统，从而导致细胞死亡。在∙OH、单线态氧（1O2）、超氧阴离子（O2¯）、H2O2、pH五种活性成分中，∙OH和1O2对溶液中酵母的杀菌贡献最大。其中∙OH主要攻击细胞膜系统，导致细胞遭受氧化压力；1O2主要攻击胞内线粒体膜，导致能量代谢紊乱；溶液中较低的pH可以破坏胞内酸碱平衡，从而降低细胞膜电位；而O2¯主要作为1O2的前体发挥作用，H2O2对酵母杀菌的贡献较小。上述研究成果揭示了沿面放电等离子体产生的主要活性成分及其对酵母细胞的杀灭机理，对沿面放电等离子体在杀菌领域的应用提供重要理论基础。