Oct4表观遗传修饰影响鸡胚胎生殖细胞生物学特性的机制研究

胚胎生殖细胞（EG）做为胚胎干细胞（ES）的来源之一，具有与ES相似的特性，阐明其自我更新的相关机制已成为干细胞领域的另一个热点，具有重要的理论价值和应用前景。做为维持干细胞全能性最主要的内源性调节因子，oct4表观遗传修饰是哺乳动物来源的ES增殖分化的重要分子开关。最近已证实禽类（鸡）中亦存在oct4的同源基因PouV，然而oct4表观遗传改变对鸡EG生物学特性的影响机制尚无报道。本课题拟在前期工作基础上，以oct4为切入点，1)探讨鸡EG细胞不同分化阶段oct4上游调控序列DNA甲基化的改变情况及相关机制；2)研究鸡EG细胞不同分化阶段oct4上游调控序列组蛋白H3、H4乙酰化改变的特点；3)观察特异性抑制剂单独（联合）应用后对已分化拟胚体（EB）生物学特性的影响。本研究旨在从正反两个方面揭示oct4表观遗传改变对鸡EG多能性维持及其分化进程的影响，并初步阐明相关的分子机制。

本课题以鸡胚胎生殖细胞(EG)为模型，以与胚胎干细胞发育全能性密切相关的转录因子oct4为切入点，系统研究了鸡胚胎生殖细胞分化过程中oct4上游序列的表观遗传改变，并初步阐明了可能的分子机制，相关研究成果已整理发表。本研究主要包括四部分内容：.1)建立了稳定的鸡EG体外自发分化流程：包括生殖腺原始生殖细胞的分离；EG细胞的克隆、传代及鉴定；悬滴法诱导EG自发分化为类胚体(EB)；.2)EG分化过程中DNA甲基化对oct4表达的影响：分别以EG和EB作为研究对象，焦磷酸测序对oct4基因不同区域的DNA甲基化水平进行定量分析，进而证明了在EG向EB的分化过程中，检测区域CpG位点甲基化明显，而且与oct4的表达水平呈负相关；构建了pGL3-Basic-0.6和pGL3-Basic-1.0荧光素酶报告载体，体外甲基化及细胞转染实验证明，甲基化载体荧光素酶活性显著降低，进一步证明了DNA甲基化对oct4表达的抑制作用；通过分析DNA甲基化相关基因(dnmt1、dnmt3a、dnmt3b)表达水平对可能的机制进行了初步分析。.3) EG分化过程中H3组蛋白乙酰化对oct4表达的影响：利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术，分析了oct4基因不同区域H3组蛋白乙酰化情况，证明了H3组蛋白乙酰化水平与oct4表达水平正相关；通过分析组蛋白乙酰化相关基因(HAT、HDAC3)表达水平对可能的机制进行了初步分析。.4)表观修饰抑制剂对EB细胞oct4表达的影响：通过单独（或联合）应用DNA甲基化抑制剂 (5’-AZA)及组蛋白去乙酰化抑制剂(TSA)，以已分化的类胚体（EB）为对象，观察了不同处理方法oct4表达水平的影响，进而从反向验证了DNA甲基化及组蛋白乙酰化与oct4表达的关系。