PGC-1α/UCP2信号通路在飞燕草素抑制血管内皮细胞线粒体损伤中的作用

Delphinidin-3-glucoside belong to the widespread class of phenolic compounds and have been reported to exert beneficial properties against cardiovascular diseases due to their multitude biological activities. Our previous studies have shown that delphinidin-3-glucoside may have inhibitive effects on oxidative-stress-induced vascular endothelial dysfunction. However, the mechanism has not been elucidated. Excessive production of reactive oxygen species (ROS) in the mitochondria plays a major role in the development of endothelial dysfunction. And the ROS production is regulated by the uncoupling protein 2 (UCP2), which is activated by the peroxisome proliferator activated receptor (PPAR)γ coactivator 1-α (PGC-1α). In this study, we aim to explore the role of PGC-1α/UCP2/ROS signaling pathway in the inhibition of endothelial mitochondrial dysfunction by anthocyanins. qRT-pcr, western blotting analysis, Laser Confocal Microscope, reporter gene and RNAi were applied to measure the activity of PGC-1α, the expression and activity of UCP2, oxidative phosphorylation of the lectron transfer chain, and the ROS production, The findings may provide a basis for the design of potent antiatherosclerotic agents that will have therapeutic potential in the prevention of AS.

本实验室前期研究发现，存在于多种天然有色植物中的飞燕草素（Dpg）能显著抑制血管内皮细胞功能障碍，对动脉粥样硬化（AS）可能具有潜在的防治作用，但分子机制尚不明确。线粒体活性氧（ROS）增加是导致内皮功能障碍的重要诱因，其生成主要受线粒体解偶联蛋白（UCP2）调控，而UCP2的表达及活性与过氧化物酶增殖激活受体辅助活化因子1( PGC-1α)密切相关。本项目拟在前期研究基础上，围绕内皮细胞线粒体损伤这一AS发生的早期事件，运用激光共聚焦、免疫印迹、实时PCR、荧光素酶报告基因、干扰RNA等方法，针对线粒体活性氧生成机制，从PGC-1α活性调节、UCP2表达及活性、电子传递链氧化磷酸化、ROS生成等方面阐明PGC-1α/UCP2信号通路在Dpg抑制内皮细胞线粒体损伤中的作用机制。该项目的突出意义旨在深入揭示飞燕草素抗AS作用的分子机制，为寻找AS防治的新策略提供理论依据。

研究发现，花色苷是植物性食物中一类重要的预防AS的生物活性成分，广泛存在于各类有色水果和蔬菜中。然而，花色苷抗AS作用的相关机制尚未完全阐明。体内代谢和生物利用的研究发现，花色苷吸收后体内清除速率快、半衰期短，导致其生物利用率很低，这与花色苷显著的心血管保护效应形成了明显的反差，提示其中可能存在血管内皮或血管壁组织对花色苷的有效摄取和组织靶向分布。此外，近期研究发现，血管内皮细胞自噬在动脉粥样硬化发生发展中扮演重要角色。适度的自噬能通过降解细胞内氧化损伤物质，尤其是线粒体，保护内皮细胞抵抗氧化应激的损伤，从而抑制动脉粥样硬化的发生发展。花色苷是否能够通过诱导细胞自噬抑制内皮细胞氧化损伤，以及相关作用机制如何，还有待进一步研究。本课题中，我们在实验室前期工作的基础上，深入研究了飞燕草素在血管内皮细胞的摄取利用及抑制内皮细胞氧化损伤效应的分子机制。我们首先分别在动物实验和细胞实验中，利用Dpg的自发荧光特性，研究了Dpg在血管内皮细胞中的跨膜转运、定位分布以及动脉血管壁组织吸收特征；然后通过构建oxLDL诱导的内皮细胞功能障碍模型，观察Dpg对细胞活力、凋亡、自由基水平、及线粒体功能障碍、线粒体凋亡相关蛋白表达的影响；最后，我们利用电子显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、siRNA、Western blot等方法及特异性抑制剂，探讨了Dpg对内皮细胞自噬的影响以及AMPK/SIRT1/自噬信号通路在Dpg抑制内皮细胞功能障碍中的作用机制。结果如下：(1) Dpg可被内皮细胞摄取并在细胞中以原型形式存在，主要分布在内皮细胞的细胞浆、细胞膜。细胞存在SGLT1的细胞膜表达，沉默SGLT1后细胞对Dpg的摄取被阻断。(2) Dpg能显著抑制oxLDL导致的内皮细胞凋亡。对线粒体功能障碍的研究表明，Dpg能显著抑制ROS和O2-等自由基增加，线粒体膜电位（△ψ）降低及线粒体膜通透性转换孔（mPTP）持续开放。通过siRNA沉默SGLT1受体发现凋亡因子AIF、Cyt C、Bax、Caspase-3表达增加，抗凋亡因子Bcl-2表达降低。(3) Dpg能显著上调AMPK和SIRT1的表达水平，采用AMPK和SIRT1的siRNA和特异性抑制剂能显著降低Dpg诱导的细胞自噬。研究表明：Dpg可能通过AMPK-SIRT1诱导内皮细胞自噬，抑制内皮细胞功能障碍。