DNA成环关键蛋白CTCF的结构与功能研究

Eukaryotic genome spatially packs into a nonrandom structure, and produces a large number of DNA loops. During cell differentiation and tumorigenesis, the structure of genome alters accordingly, which indicates the formation and regulation of genomic 3D structure is a fundamental issue in life science. While structures of DNA, nucleosome, and chromatin fiber are well studied, and the formation of the overall genomic structure is widely recognized, little is known on the molecular mechanism of establishing the interaction of DNA sites in distance. Here we propose to study the mechanism of the zinc-finger protein CTCF mediated DNA looping. Taking an approach of structure study, we propose to determine structures of CTCF protein and CTCF-DNA complex. And in combination of functional study, we expect to gain a better understanding of DNA looping. Additionally, due to the high probability of the CTCF zinc-finger involvement in dimerization, the study will shed light on the neglected field of zinc-finger mediated protein-protein interaction.

真核细胞基因组在空间上呈现非随机排布的特点，构建出大量DNA成环结构。随着细胞的分化以及癌变，基因组空间结构也发生着变化。这表明基因组高级结构的形成与调控是生命现象最根本的问题。在从DNA、核小体、染色质纤维结构到全基因组结构构成之间，缺少了对远程相互作用节点分子作用机制的深入研究。本课题旨在研究节点构成蛋白CTCF介导DNA成环的分子作用机制，从而填补这一空白。以结构分子生物学方法，通过确定CTCF蛋白及其与DNA复合物的晶体结构，结合相对应的功能研究，解释DNA成环的机制。此外，由于CTCF的锌指区域极可能介入二聚体的形成，本课题的研究成果将对尚且鲜有研究的锌指介导的蛋白质间相互作用提供重要的信息。

本项目旨在通过结构功能研究，了解CTCF在DNA成环中的作用机制。在结构方面，我们采用冷冻电镜分析，获得了分辨率14Å的CTCF全长蛋白与靶点DNA复合物结构。研究结果不支持CTCF通过二聚引起DNA远程相互作用进而形成DNA环的推测，DNA成环可能需要其它因子的介入。.对于CTCF中央连续锌指区域，我们在保证不影响锌指三维结构的条件下突变结合DNA的关键氨基酸，由此构建了11个单个锌指失活蛋白，并以此对7个明确靶点DNA序列进行结合分析。研究结果显示，该方法可以有效检测锌指单元在结合不同靶点中发挥的作用，总体结合模式与晶体结构相吻合，但是针对不同的DNA序列，CTCF的结合模式有一定的差异。该差异有可能被用于区别不同的CTCF结合位点，达到精细调控基因组空间结构的功能。.在针对CTCF锌指以外区域的研究中，我们有幸发现一段序列与金属离子存在相互作用。鉴于已有文献报道CTCF两端序列可以结合多种蛋白核酸因子，金属离子的介入可能影响该区域生化功能，进而引起基因组结构的变化，具有重要的生物学意义。同时，我们发现同源蛋白CTCFL相关序列同样具备结合金属离子的能力，但是结合模式不同。鉴于CTCFL是一个癌症相关蛋白，该发现有一定的临床应用前景。