基于PTEN-PI3K-AKT/SGK1通路探讨清热解毒法中药复方及其组分配伍治疗肝癌的分子机制

Traditional Chinese medicine is an important part of the system for the prevention and control of hepatocellular carcinoma. Given our research group had found Rhizoma coptidis-Rheum officinale-Cinnamon compound with heat-clearing and detoxifying effect could effectively inhibit the proliferation of hepatoma cells and adjust the abnormality of PTEN-PI3K-AKT/SGK1 pathway; and some papers had reported Berberine, Emodin and Cinnamaldehyde, which are the effective components of Rhizoma coptidis, Rheum officinale and Cinnamon respectively, had good effect for hepatocellular carcinoma treatment, the hypothesis was raised that PTEN-PI3K-AKT/SGK1 pathway is the action mechanism of suppressing tumor of this compound and its effective components compatibility. Based on above hypothesis, firstly, this study will establish hepatoma cells without the expression of PTEN gene which is silenced by CRISPR method. Then through in vitro and in vivo experiments, the best effective constituents compatibility of the compound will be optimized according its effect on inhibiting hepatoma cells proliferation in vitro and solid tumor growth of nude mice with hepatocellular carcinoma in vivo. Lastly, the impact of the compound and its best components compatibility on the proliferation, apoptosis and PTEN-PI3K-AKT/SGK1 pathway of hepatoma cells and hepatocellular carcinoma nude mice with different expression of PTEN gene will be measured. All the research results will verify the hypothesis and provide theoretical basis for developing the compound, especially its effective components compatibility as a valid new drug for hepatocellular carcinoma treatment.

中医药是肝癌综合防治体系的重要组成部分。基于课题组前期发现清热解毒法黄连-大黄-肉桂复方可有效抑制肝癌细胞增殖和调节PTEN-PI3K-AKT/SGK1通路的异常，及小檗碱、大黄素和桂皮醛分别为方中黄连、大黄和肉桂治疗肝癌的主要有效成分的文献报道，本项目提出PTEN-PI3K-AKT/SGK1通路是该复方及方中以上三种有效组分配伍发挥抑癌作用的重要途径的假说。基于此，本研究首先采用CRISPR法建立PTEN基因沉默的人肝癌细胞株，然后通过体外和体内实验，优化复方有效组分抑制肝癌细胞增殖和肝癌移植瘤裸鼠肿瘤生长的最佳配伍，再观察复方及其组分最佳配伍对PTEN正常表达和PTEN沉默的肝癌细胞和两种细胞建立的肝癌裸鼠模型的肿瘤组织增殖和凋亡的影响，以及其对PTEN-PI3K-AKT/SGK1通路的调节作用，以验证假说。其研究结果可为将该复方、特别是其组分配伍开发为有效的抗肝癌新药提供理论基础。

基于课题组前期发现清热解毒法黄连-大黄-肉桂复方可有效抑制肝癌细胞增殖和调节PTEN-PI3K-AKT/SGK1通路的异常，以及小檗碱、大黄素和桂皮醛分别为方中黄连、大黄和肉桂治疗肝癌的主要有效成分的文献报道，项目申请时提出了PTEN-PI3K-AKT/SGK1通路是该复方及方中以上三种有效组分配伍发挥抑癌作用的重要途径的假说。据此设计实验，采用CRISPR法建立了PTEN基因沉默的人肝癌细胞株，然后通过体外和体内实验，优化复方有效组分抑制肝癌细胞增殖和肝癌移植瘤裸鼠肿瘤生长的最佳配伍，再观察了复方及其组分最佳配伍对有无PTEN表达的肝癌细胞及以其建立的肝癌裸鼠肿瘤组织增殖和凋亡的影响，以及其对PTEN-PI3K-AKT/SGK1通路的调节作用，实验结果显示：（1）大黄-黄连-肉桂复方及其优化后的组分配伍可抑制肝癌细胞的增殖和肝癌小鼠肿瘤的生长；（2）所研药物并不直接升高PTEN表达，而是在体外细胞中以抑制AKT为主、在肝癌小鼠中以抑制SGK1为主，提示药物经在体内代谢和吸收后，其起效成分有可能发生了变化，导致靶点有所不同；（3）虽然药物并未能使抑癌基因PTEN表达直接升高，但部分敲除PTEN后，下游相关分子的mRNA表达趋势大多相反，而绝大部分蛋白表达水平却是一致的，提示在改变肿瘤细胞PTEN表达后，药物通过对作用途径中不同层次和靶点的选择性调节，仍能正常发挥其抑制肝癌的作用；（4）同一平行实验，对肝癌的抑制作用及相关分子的调节作用，组分配伍与复方的作用是基本一致的，即组分配伍在所观察的指标中，基本能重现复方的功能，且机制也近似。以上结果基本印证了原假说，其结论不仅从理论上印证了中医复方、甚至组分配伍对机体具有多靶点、多层次作用的特点，也为进一步将该复方、特别是其组分配伍开发为有效的抗肝癌新药提供了理论依据。