USP17/HDAC2在激素抵抗性哮喘中的作用研究

Unresponsiveness of refractory asthma to corticosteroids treatment is urgent to solve. Previous studies have proved that steroid-resistant of the chronic airway disease is related to the decline of HDAC2 stability and activity in airway epithelial cells. Our preliminary experiment has shown that USP17 could regulate HDAC2 in HEK293 T cells. Therefore, we speculate that USP17 could regulate HDAC2 in steroid-resistant asthma: ① Testify the interaction of USP17 and HDAC2 by Co-IP，the stability and activity of HDAC2 when overexpression and knockdown USP17 in human airway epithelial cells. ② Analyze the induced sputum, BALF and airway biopsy specimen of steroid-resistant asthmatics to illustrate its airway expression patterns of USP17 and HDAC2. ③ In vivo, to compare the differences of inflammatory cytokines, lung function, airway responsiveness, HDAC2 stability and activity in OVA sensitized and challenged conditional epithelial USP17 knockout mice treated with/without steroid. This project will provide new molecular target for the treatment of steroid-resistant asthma.

激素抵抗性哮喘是临床上亟待解决的问题，既往研究认为慢性气道疾病激素抵抗与气道局部HDAC2稳定性和活性下降有关。我们前期研究发现USP17能够调控HDAC2，故推测USP17对HDAC2的调控在难治性哮喘激素抵抗中发挥关键作用，本课题拟通过如下研究证实上述假设：① 通过免疫共沉淀验证USP17和HDAC2存在相互作用，检测USP17过表达和基因沉默时HDAC2的稳定性和活性，体外明确气道上皮细胞中USP17对HDAC2的调控；② 采集激素抵抗性哮喘患者诱导痰、支气管肺泡灌洗液和气道活检标本，揭示其气道局部USP17、HDAC2表达特点；③ 构建USP17气道上皮条件性基因敲除小鼠哮喘模型，并予激素干预，在体内探究USP17通过对HDAC2的调控在激素抵抗性哮喘中的作用。该研究将为激素抵抗性哮喘的治疗提供新的分子靶点。

难治性哮喘/激素抵抗性哮喘是临床的热点和难点问题，其发生机制复杂，危险因素较多，临床上治疗困难。故解决哮喘难治问题尤为重要。既往研究认为慢性气道疾病激素抵抗与气道局部HDAC2稳定性和活性下降有关。我们课题组采用免疫共沉淀、免疫电泳、过表达和敲低实验等发现USP17去泛素化HDAC2从而维持其蛋白稳定性。而烟雾等外界刺激会导致气道上皮细胞USP17表达下降，无法维持HDAC2蛋白稳定性和活性，从而导致哮喘患者对激素治疗不敏感。那么USP17可以作为治疗吸烟导致的激素抵抗性哮喘的重要靶点。此外，我们课题组还拓宽了难治性哮喘/激素抵抗性哮喘免疫发病机制的研究范围。首先，流式细胞术和蛋白免疫电泳法均发现去泛素化酶USP4在Th17细胞中高表达，免疫共沉淀方法发现USP4与Th17细胞特征性转录因子RORrt相互作用，并对其蛋白产生稳定作用，从而促进Th17细胞分化以及在Th17/Treg细胞的平衡中发挥重要作用。从小鼠脾脏中富集CD4+T细胞，体外细胞因子刺激（TGF-beta、IL-6等）发现USP4主要通过TGF-beta这一途径发挥调控作用。通过构建USP4基因敲除小鼠，建立哮喘疾病模型发现，与野生型小鼠对比，USP4敲除小鼠肺部炎症细胞浸润明显减少。获取小鼠支气管肺泡灌洗液，肺组织和纵膈淋巴结单细胞悬液，FACs分析发现USP4敲除后Th17细胞比例明显下降，而Treg细胞比例升高，Treg细胞特征性转录因子Foxp3表达量升高。促进Treg细胞向肺组织炎症局部迁移的趋化因子受体CCR6表达也升高。而使用USP4抑制剂处理哮喘小鼠同样也能抑制气道炎症。那么，USP4可以作为治疗Th17细胞为主的激素抵抗性哮喘的重要靶点。该研究的完成可以拓展难治性哮喘/激素抵抗性哮喘免疫发病机制的探索，丰富哮喘治疗的手段，为今后哮喘的个体化治疗提供重要依据。