组织工程化胚胎干细胞来源神经元治疗帕金森病的实验研究

Parkinson's disease is a serious harm human health of disease, traditional treatment with drugs and surgery, give priority to, but in the late disease, patients will still appear all sorts of complications. Stem cell transplantation replacement therapy may promote cell regeneration and damaged nerve area vascular remodeling, in animal experiments have made some progress. Some research suggests that people embryonic stem cells have multiplex differentiation potential, and other sources of stem cells, compared to establish cell lines ChuanDai many times, still can maintain its biological characteristics. At present stem cell transplantation discrete cells with local injection is given priority to, but stem cells transplantation high mortality rate, easy to form a teratoma, need to find more effective transplantation methods. This research focuses application together N-isopropyl acrylamide material as the biological stents,using the special cell strain- the 4th of Hainan Province, will human embryonic stem cells of neurons grown in coating induction and preparation stem cells thin layer, through the local injections of stem cells thin layer pieces (cell sheet), improve cell transplantation methods, and use the synapse formation inducers prompted, and discrete stem cell transplantation comparison, and through the molecular biology, cytology and behavior etc observation method after transplantation the formation of the neural network, the improvement of the movement function and discuss the possible mechanism.

帕金森病是严重危害人类健康的疾病，传统治疗以药物、手术治疗为主，但在疾病后期，患者仍然会出现各种并发症。干细胞移植替代疗法则可促进神经细胞再生和受损区血管重塑，在动物实验中有取得一定进展。已有研究表明，人胚胎干细胞具有多向分化潜能，与其他来源的干细胞相比，建立细胞系多次传代后，仍能保持其生物学特性。目前干细胞移植以离散细胞局部注射为主，但移植后干细胞死亡率高，容易形成畸胎瘤，需寻找更有效的移植方法。本研究拟应用多聚N-异丙基丙烯酰胺材料作为生物支架，采用的我省特有的胚胎干细胞系-海南4号作为研究对象，将人胚胎干细胞诱导的神经元种植在涂层上并制备干细胞薄层，通过局部注射干细胞薄层碎片（cell sheet），改进细胞移植方法，用诱导剂促使其突触形成，与离散干细胞移植进行对照，并通过分子生物学、细胞学及行为学等方法观察移植后神经网络的形成，运动功能的改善情况并探讨其可能机制。

研究目的.本研究评价人胚胎干细胞（hESCs）源多巴胺能神经元（DA）的离体功能特性，以及观察离散细胞法和细胞薄片法等移植手段对帕金森病大鼠模型移植效果的影响。.研究方法.本研究选用了自有的、不同饲养层上建系的人HN4（混合饲养层，鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞=1:1，MEFs：HFFs=1:1）和P96（人包皮成纤维细胞，HFFs）细胞系进行筛选。分化实验在无饲养层培养系统中完成。采用SMAD通道双抑制剂诱导启动神经分化，采用倒置相差显微镜、免疫细胞化学法、实时荧光定量PCR、扫描电镜（TEM）和透射电镜（SEM）、以及膜片钳等检测方法对两个细胞系源DA神经元各种生理特征评价和筛选。采用单侧两点（左侧黑质致密部+黑质纹状体通路）注射6-OHDA制备PD大鼠模型，离散细胞法和细胞薄片法进行移植，通过行为学评分、免疫细胞化学等方法比较了不同移植手段的移植效果。通过SPSS19.0软件进行分析。P<0.05显示有统计学差异。.研究结果.HN4和P96细胞系在分化过程中均表现出从典型铺路石样、高核质比的干细胞形态分化为典型神经元的形态学变化过程。免疫细胞化学、实时荧光定量PCR结果和电镜显示，HN4和P96系可分化为典型的DA神经元，P96系分化细胞中TH阳性细胞比率更高 (P <0 .05)。膜片钳结果显示：在电压钳模式下，HN4和P96源多巴胺能神经元均记录到了电压门控性钠、钾离子电流，配体门控性电流及自发性突触后电流。在电流钳模式下，HN4和P96源多巴胺能神经元均记录到了动作电位序列发放。而且其动作电位特征符合在体多巴胺能神经元的标准。P96源DA神经元的电生理兴奋性高于HN4源DA神经元。最终选用人包皮饲养层上建系的P96系作为移植源。在体移植实验显示，移植16周后，PD模型组移植的神经元均可以存活，整合入宿主神经网络，阿扑吗啡转圈率较未移植组均明显下降。与离散细胞组相比，细胞薄片组DA神经元的存活率高，转圈率下降明显。.结论：.HFFs上建系的P96系更倾向于分化为DA神经元，而且此类DA神经元神经兴奋性更高；人胚胎干细胞源DA神经元移植可以在PD模型内存活并整合入宿主神经网络，改善PD模型的症状，促进功能恢复。生物薄片移植法可以提高移植神经元的存活率。本研究将促进干细胞疗法治疗帕金森病的临床转化。