产内切菊粉酶放线菌筛选及放线菌内切菊粉酶合成的碳源调控机理研究

Fructo-oligosaccharide is one of the best functional food ingredients, and inulin hydrolyzing by endo-inulinase is the only way to obtain fructo-oligosaccharide. There are few reports on the production of endo-inulinase by actinomycetes, and not to mention the carbon source regulation mechanism on biosynthesis of this enzyme. So it is important to reveal the regulation mechanism in actinomycetes. In this work, based on the constructed actinomycetes library, we will screen the strains that can produce endo-inulinase, and build the endo-inulinase producing actinomycetes library. The effect of regulation on endo-inulinase activity will be identified by using different carbon sources, and then transcriptome analysis will be used to analyze significant differences in gene expression between up-regulation and down-regulation ones. Together with the protein function annotation and GO/KEGG enrichment, the target genes involved in the regulation of endo-inulinase production will be screened, and the regulation mechanism of carbon source on the endo-inulinase biosynthesizing will be preliminarily revealed. The results in this research have theoretical and practical significance for preliminarily revealing the carbon source regulation mechanism of endo-inulinase synthesis in actinomycetes, and for constructing the genetically engineering actinomycetes with high activity of endo-inulinase.

菊粉低聚果糖是理想的功能性食品配料，内切菊粉酶水解菊粉是其制备的唯一方法。目前关于产内切菊粉酶的放线菌报道较少，而放线菌内切菊粉酶合成受碳源调控机制研究更无报道。因此，揭示放线菌内切菊粉酶合成的碳源调控机制是亟待解决的科学问题。本项目拟在前期构建的放线菌资源库基础上，筛选并建立产内切菊粉酶放线菌资源库。其次，在完成不同碳源对放线菌内切菊粉酶合成的调控分析基础上，采用转录组技术，进行产内切菊粉酶放线菌的基因差异分析；结合蛋白功能注释及GO和KEGG富集分析，明确与放线菌内切菊粉酶合成及碳源调控有关的目标基因,初步揭示放线菌内切菊粉酶的碳源调控机制。研究结果对阐明放线菌内切菊粉酶合成的碳源调控分子机制，开展高产内切菊粉酶放线菌工程菌构建具有重要的理论和应用意义。

菊粉酶是以菊粉为原料生产高果糖浆和低聚果糖的关键酶，而微生物是目前菊粉酶的重要来源，但关于产菊粉酶的放线菌报道较少。因此，开展产菊粉酶放线菌的筛选，发酵条件的优化以及挖掘放线菌产酶基因的研究具有重要的理论和应用意义。.项目执行期间，根据产菊粉酶微生物来源的文献资料报道，先后采集了50份不同生态类型样品。通过设计不同样品处理方法、选择性分离培养基等，共获得105株产菊粉酶的代表性菌株，归属18个属59个种；其中放线菌72株，归属为8个属43个种，并发现1个潜在的新种，1个可产高温菊粉酶的菌株SJC66。同时，研究了产菊粉酶微生物的多样性，并在GenBank数据库登录了62个16S rDNA序列，序列号分别为MN 749853~MN 826820。.利用单因素和响应面实验，分别优化了菌株SJC138、SJC66、S1801、S1802和B1801的发酵培养基和发酵条件，优化后酶活性分别是优化前的5.02、1.51、1.13、3.2和2.73倍。研究发现，产菊粉酶菌株的发酵培养基中添加碳源为麸皮和混合氮源(有机氮源为豆粕、大豆粉或花生饼粉，无机氮源为氯化铵或硫酸铵)，有利于提高菌株产酶活性。此外，对菌株SJC138和SJC66所产菊粉酶进行了分离纯化并获得高纯度的菊粉酶，采用SDS-PAGE估算其分子量分别为64.0kD和29.65kD。酶学性质研究表明，2种酶均对底物菊粉具有很高的亲和性。其中菌株SJC66所产菊粉酶为高温菊粉酶，酶反应温度为70℃，是一种具有巨大应用潜力的酶。.采用PacBio RSII测序技术测定了菌株S501的完整基因组。该基因组由1个7163085bp大小的线型染色体和1个28779bp的线型质粒组成，包含了9630个蛋白质编码基因和94个RNA基因。通过与GO、COG、KEGG和CAZy数据比对分析，注释了菌株S501基因组中与生物学途径有关基因、具有生物学功能的蛋白编码基因和功能蛋白簇、功能酶类和代谢途径等。分析了其主要碳水化合物代谢途径、氨基酸代谢途径以及与次级代谢产物合成相关基因。.项目研究结果为建立产菊粉酶微生物资源，特别是放线菌资源以及这些资源的开发应用奠定基础。